Iniziare mescolando 200 microlitri di siero ridotto con due microgrammi di qualsiasi DNA plasmidico separatamente in una provetta sterile di microcentrifuga. Ripetere questa operazione per altri due plasmidi in tubi separati. Quindi nel nuovo tubo due, mescolare 200 microlitri di siero ridotto con sei microlitri di reagente di trasfezione e mescolare il contenuto mediante pipettaggio.
Incubare i tubi per cinque minuti a temperatura ambiente prima di mescolare il contenuto del tubo due al tubo uno. In provette separate, ripetere la miscelazione degli altri due plasmidi con un reagente di trasfezione. Incubare la miscela per 20 minuti a temperatura ambiente.
Successivamente, in senso gocciolato, aggiungere i complessi di trasfezione ai piatti di imaging seminati con colture cellulari HeLa, garantendo un'equa distribuzione sull'intero piatto. Un'ora prima dell'imaging, aprire la valvola del serbatoio di anidride carbonica e accendere il controller ambientale per il microscopio. Utilizzando le frecce su e giù sul touchpad, regolare la temperatura a 37 gradi Celsius e l'anidride carbonica al 5%Premere Set al termine.
Per regolare le impostazioni del laser, attivare il laser a luce bianca facendo clic sulla scheda Acquisisci e selezionando Apri panoramica laser. Nella finestra di dialogo, attivare il laser a luce bianca. Immettere la potenza laser come 85%Fare clic sul pulsante di controllo dell'eccitazione e selezionare la potenza massima dal menu a discesa.
Inizia il percolato di estere etilico tetraetilrodamina o TMRE, imposta il laser di eccitazione a 514 nanometri e la finestra degli spettri di emissione a 524-545 nanometri per YFP. Successivamente, per MitoTracker Deep Red, impostare il laser di eccitazione su 641 e la finestra degli spettri di emissione su 650-750 nanometri. Allo stesso modo, per TMRE, impostare il laser di eccitazione su 555 nanometri e la finestra degli spettri di emissione su 557 a 643 nanometri.
Iniziare l'impostazione di acquisizione dell'immagine selezionando la scheda Acquisizione e regolando il formato su 1024 per 1024. Regola la velocità su 600 nel menu a discesa. Quindi fare clic sul pulsante Media linea e dal menu a discesa, selezionare tre.
Attivare la scansione bidirezionale e impostare il fattore di fase e zoom rispettivamente su 22,61 e 1,50. Una volta fatto, selezionare le celle in base al segnale fluorescente YFP facendo clic su quella di impostazione YFP e premendo Fast Live. Quindi regolare il guadagno e l'intensità di YFP e quindi selezionare le celle in base al segnale fluorescente YFP.
Per visualizzare la piastra di controllo DMSO nell'esperimento TMRE, regolare il guadagno e l'intensità del segnale TMRE impostando due in modo che l'intensità della rete mitocondriale sia appena al di sotto della saturazione. Mantieni costante il guadagno e l'intensità per TMRE. Quindi regolare il guadagno e l'intensità del MitoTracker impostandone uno in modo che la rete mitocondriale sia visibile, ma debole.
Una volta completate le impostazioni di guadagno e intensità, fai clic su Avvia per acquisire un'immagine. Acquisire immagini di 20 cellule per condizione sperimentale.
