Per misurare l'intensità della fluorescenza delle cellule HeLa trasfettate nel software ImageJ, fare clic su file e selezionare Apri. Nella finestra di dialogo, selezionare i file di imaging per l'esperimento e fare clic su OK. Una volta visualizzata la finestra delle opzioni di importazione dei bioformati, selezionare i canali divisi e fare clic su OK.
Negli esperimenti con tetrametilrhodamina, estere etilico, perclorato o TMRE, YFP è il primo canale, MitoTracker è il secondo canale e TMRE è il terzo canale. Regola la luminosità selezionando l'immagine, quindi regola e infine la luminosità. Quindi, carica la regione di interesse salvata o il ROI facendo clic su Analizza, quindi su Strumenti, quindi su Gestione ROI.
Nel gestore ROI, fai clic su Altro, quindi apri dall'elenco e seleziona il ROI salvato. Quindi misurare l'intensità fluorescente di cinque regioni casuali in una singola cella selezionando il ROI salvato dal gestore del ROI e spostando il ROI in una posizione casuale all'interno di una cella. Per misurare l'intensità della fluorescenza, premere M sulla tastiera e ripetere l'operazione con quattro regioni aggiuntive non sovrapposte.
Quando viene visualizzata una finestra di dialogo con l'area e i valori grigi medi, copiare e incollare i valori in un foglio di calcolo per l'analisi. I risultati per le intensità di fluorescenza TMRE e MitoSOX hanno mostrato che il loro trattamento con il noto agente disaccoppiante CCCP ha ridotto l'intensità di fluorescenza TMRE rispetto alle condizioni di controllo. Inoltre, il trattamento con 20 micromolari CCCP ha indotto la produzione di superossido e aumentato l'intensità della fluorescenza MitoSOX.
In condizioni di stress CCCP lieve o a cinque micromolari, l'espressione di Parkin wild-type e Parkin T240R ha determinato una maggiore intensità di TMRE rispetto al vettore di controllo YFP vuoto. L'intensità di MitoSOX era inferiore nelle cellule che esprimono Parkin wild-type e Parkin T240R rispetto alle cellule che esprimono il vettore di controllo YFP, suggerendo che l'espressione di parcheggio aiuta a mantenere la salute della rete mitocondriale preservando potenziali di membrana mitocondriale più elevati e bassi livelli di superossido.
