Dopo aver fissato il bulbo oculare enucleato del topo eutanasia, trasferirlo su un vetrino e metterlo sotto un microscopio da dissezione. Usando una pinza, bloccare il margine della cornea per impedire il movimento del bulbo oculare. Con le forbici da dissezione, tagliare intorno alla cornea ad una profondità di circa un millimetro attraverso il limbus sclerale della cornea, quindi rimuovere la lente e il corpo vitreo.
Tenendo il disco ottico al centro, tagliare la retina radialmente lungo i quattro quadranti, raggiungendo circa i 2/3 del raggio della retina. Morseggiare uno dei bordi sclerali usando una pinza dentata. Tenere il bordo della sclera con una pinza non dentata e spostarsi dalla pinza dentata verso la base della sclera.
Sbucciare con cura la retina. Bagnare la retina con 200 microlitri di PBS usando una pipetta. Rimuovere il PBS in eccesso con carta assorbente e appiattire la retina con una piccola spazzola a setole, se necessario.
Aggiungere lentamente metanolo freddo goccia a goccia sulla superficie interna della retina fino a coprire completamente. Una volta che la retina diventa bianca e sviluppa una maggiore tenacità, appiattire delicatamente la retina e rimuovere le impurità, come le membrane pigmentarie residue e il corpo vitreo, con una piccola spazzola di setole. Dopo aver invertito la retina, trattarla con metanolo come precedentemente dimostrato e trasferirla in un pozzetto di 24 pozzetti, immergerla nel metanolo e conservarla a 20 gradi Celsius per una o due ore per un'immunocolorazione immediata.
Quindi sciacquare la retina con PBS dopo aver rimosso il metanolo dalla piastra. Le cellule gangliari del retinolo delle retine prima e dopo il trattamento con metanolo sono state visualizzate utilizzando la microscopia confocale, che ha indicato che i 12 mesi di conservazione del metanolo non hanno influenzato l'immunocolorazione RGC.
