Iniziare aspirando il supporto dalle piastre contenenti aderente grezzo 264.7. Aggiungere 10 millilitri di PBS per piastra da 15 centimetri. Utilizzare un raschietto per rimuovere le celle e tirarle in un singolo tubo da 50 millilitri.
Pipettare la sospensione cellulare su e giù per omogeneizzare. Quindi, trasferire il 5% del volume della sospensione cellulare in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Centrifugare a 300G per cinque minuti a temperatura ambiente.
Scartare il surnatante e posizionare il pellet di frazione cellulare totale sul ghiaccio. Dopo aver centrifugato la sospensione rimanente come descritto in precedenza, aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di tampone mitocondriale ghiacciato. Centrifugare la sospensione a 300G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Risospendere il pellet in 0,5 millilitri di tampone mitocondriale freddo. E trasferire la sospensione su un tubo da 1,5 millilitri. Quindi, omogeneizzare la sospensione, bypassandola 30 volte attraverso un ago calibro 25 montato su una siringa da un millilitro.
Quindi aggiungere un millilitro di tampone mitocondriale freddo al tubo e mescolare per inversione. Dopo aver centrifugato le cellule, trasferire un millilitro di surnatante in un tubo fresco su ghiaccio. Risospendere il pellet nel tampone e omogeneizzare il pellet passando attraverso un ago da 25 gauge montato su una siringa da un millilitro.
Tirare i pellet cellulari omogeneizzati e il surnatante dai passaggi precedenti in un singolo tubo da 1,5 millilitri. Centrifugare a 2.000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere il surnatante e dividerlo in quattro tubi da 1,5 millilitri.
Aumentare il volume in ogni tubo a 1,5 millilitri utilizzando il tampone mitocondriale. Capovolgere i tubi per mescolare il loro contenuto e quindi centrifugare i tubi. Rimuovere con attenzione il surnatante e il pellet cellulare bianco superiore.
Tenere uno dei quattro tubi contenenti il pellet mitocondriale marrone sul ghiaccio come frazione mitocondriale grezza. Tirare i pellet rimanenti in un nuovo tubo e rendere il volume finale di un millilitro con tampone mitocondriale. Utilizzando questo protocollo, le cellule totali e le frazioni mitocondriali grezze sono state ottenute dalla linea cellulare di macrofagi 264,7 grezzi e dal BMDM.
L'analisi immuno del sangue ha mostrato che la citrato sintasi mitocondriale era arricchita nella frazione grezza. Le proteine del citosol, della membrana plasmatica, del nucleo, del lisosoma e del reticolo endoplasmatico sono scomparse. L'analisi del proteoma ha mostrato un arricchimento di oltre dieci volte nella frazione grezza.
Gli altri sei compartimenti cellulari sono stati esauriti durante la purificazione.
