Prepararsi per l'immunocolorazione sezionando la stria vascolare dal topo e aggiungere il tessuto a una piastra a 24 pozzetti contenente 200 microlitri di paraformaldeide al 4% in 1X PBS. Incubare il tessuto per 20 minuti a temperatura ambiente. eseguire due brevi lavaggi di 1X PBS su uno shaker orbitale a basso RPM.
Rimuovere il PBS, quindi eseguire la permeabilizzazione e il blocco per un minimo di un'ora a temperatura ambiente in 300 microlitri di soluzione PBST. Quindi, colorare il tessuto con l'anticorpo primario durante la notte a quattro gradi Celsius. Quindi aggiungere un anticorpo secondario e incubare per due ore a temperatura ambiente su uno shaker orbitale a basso RPM.
Coprire la piastra per proteggere dalla luce l'anticorpo secondario contrassegnato con fluorescenza. Quindi, preparare un microvetrino più grande posizionando due piccole strisce di colla lungo l'asse di 25 mm, appena più piccole della vetrina da 18 x 18 millimetri. Posizionare una goccia di reagente di montaggio tra le strisce di colla.
Utilizzando la pinza numero 55, tamponare il minor tessuto possibile su un'estremità della SV e trasferirlo dal PBS al reagente di montaggio. Posizionare un'estremità del vetrino di copertura sul vetrino dove è stata posizionata una striscia di colla. Quindi rilasciare delicatamente il vetrino di copertura per evitare di creare bolle d'aria.
Sigillare il supporto tamponando una goccia di smalto trasparente su ogni angolo del supporto. Etichettare il campione sul vetrino di copertura, lontano dal campo di visualizzazione. Visualizza il tessuto SV al microscopio a dissezione per assicurarti che sia piatto e non vicino a bolle d'aria.
Se il tessuto SV non è orientato correttamente, provare a spingere fuori le bolle d'aria o rimuovere con attenzione il vetrino più piccolo e riposizionare l'SV. È stata preparata un'intera montatura di SV dal mouse P30 ed è stata eseguita l'imaging confocale. L'espressione di ZsGreen è stata osservata nelle cellule intermedie, GSIB4 ha marcato le cellule endoteliali e DAPI ha marcato i nuclei.
