Fresh Primary Tumor Tissue Processing to Establish Tumor Organoids and Primary Fibroblasts

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May 26th, 2023

DOI :

10.3791/200204-v

May 26th, 2023

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¹Molecular Epidemiology and Predictive Tumor Markers Group, Area 3, Ramón y Cajal Health Research Institute (IRYCIS), ²The Biomedical Research Network in Cancer (CIBERONC), ³Biobank and Biomodels Platform (PT20/0045), ISCIII research and development platforms in biomedicine and health sciences, BioBank Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS, Spanish National Biobanks Network (ISCIII Biobank Register No. B.0000678), Ramón y Cajal Health Research Institute (IRYCIS), ⁴Faculty of Medicine, University of Alcalá de Henares, ⁵Institute of Tissue Medicine and Pathology, University of Bern, ⁶Department of Molecular Oncology, Cancer Research Institute, Biomedical Research Center of the Slovak Academy of Sciences, ⁷Experimental Oncology, Molecular Oncology Program, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), ⁸Department of Surgical Oncology, National Cancer Institute, Slovak Medical University, ⁹Pancreatic and Biliopancreatic Surgery Unit, Hospital Universitario Ramón y Cajal, ¹⁰Department of Pathology, Hospital Universitario Ramón y Cajal, ¹¹Department of Radiation Oncology, Hospital Universitario Ramón y Cajal, ¹²Department of Cancer, Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols” (IIBM), ¹³Cancer Stem Cell and Fibroinflammatory Group, Chronic Diseases and Cancer, Area 3, IRYCIS

* Questi autori hanno contribuito in egual misura

Trascrizione

Iniziare posizionando il tessuto in una piastra sterile per coltura tissutale e rimuovendo il terreno in eccesso. Misura il tessuto con un righello di metallo sterile e fotografalo. Aggiungere tre millilitri di terreno DMEM/F-12 avanzato al tessuto tagliato e pipettare il tessuto su e giù per lavarlo.

Quindi lavare il fazzoletto con tre millilitri di PBS. Aspirare il terreno dalla piastra di coltura tissutale e tagliarlo in piccoli pezzi utilizzando lame sterili e due millilitri di terreno di digestione. Quindi raccogliere il tessuto in una provetta da 50 millilitri contenente cinque millilitri totali di mezzo di digestione.

Incubare la provetta a 37 gradi Celsius per un'ora. Miscelare periodicamente la sospensione pipettando verso l'alto e verso il basso. Inattiva la tripsina aggiungendo cinque millilitri di DMEM/F-12 avanzato al tubo.

Quindi filtrare il campione attraverso un filtro per pori da 70 micrometri per rimuovere eventuali detriti di grandi dimensioni. Ora pipettare due millilitri di DMEM contenente il 10% di FBS nella parte superiore del filtro e utilizzare una pipetta per raccogliere i detriti e i resti di tessuto per la coltura dei fibroblasti. Quindi placcare i detriti per la coltura dei fibroblasti.

Centrifugare il filtrato a temperatura ambiente a 200-300 G per cinque minuti, quindi aspirare il surnatante. Aggiungere cinque millilitri di DMF 12 avanzato al pellet e centrifugare nuovamente la sospensione a 300 G per cinque minuti. Per la lisi dei globuli rossi, risospendere il pellet in quattro millilitri di tampone di lisi del potassio con cloruro di ammonio e trasferirlo in una provetta da 15 millilitri.

Incubare le cellule a temperatura ambiente per due minuti. Dopo aver centrifugato la miscela alle stesse condizioni dimostrate in precedenza, aspirare il surnatante. Al pellet, aggiungere cinque millilitri di DMEM/F-12 avanzato e centrifugare di nuovo a quattro gradi Celsius.

Dopo aver aspirato il surnatante, aggiungere un millilitro di reagente di dissociazione cellulare disponibile in commercio al pellet e incubarlo per due o tre minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, centrifugare e aspirare nuovamente il surnatante. Quindi risospendere il pellet in cinque millilitri di DMEM/F-12 avanzato.

Dissociare i grumi cellulari pipettando la sospensione più volte con una pipetta P1000. Centrifugare la sospensione e rimuovere il surnatante. Successivamente, procurarsi i puntali per pipette P1000 e P200 pre-raffreddati e utilizzare i puntali freddi fissati sulla pipetta P1000 per risospendere il pellet cellulare nella matrice di membrana, prima di posizionare il Falcon sul ghiaccio per evitare la solidificazione.

Prelevare la piastra preriscaldata dall'incubatrice. Utilizzando il set di pipette P200 a 48 microlitri e utilizzando puntali freddi, creare cupole di matrice a membrana basale nella piastra preriscaldata. Quindi incubarlo per solidificare la miscela di membrane basali.

Una volta che la matrice si è solidificata, aggiungere da due a due millilitri e mezzo di DMEM/F-12 avanzato, integrato con fattori di crescita e inibitori. Le cellule tumorali sono state isolate e gli organoidi tumorali sono stati stabiliti da tessuto fresco per un periodo di 15 giorni. Occasionalmente, grandi volumi di detriti cellulari impediscono una visualizzazione accurata degli organoidi tumorali in via di sviluppo.

È stato osservato che gli organoidi in via di sviluppo variano fenotipicamente da colture isolate, arrotondate a sferoidi o aggregate, a seconda dell'origine del tumore. Le colture di organoidi possono essere contaminate da fibroblasti, un prodotto PI comune della coltura primaria di cellule tumorali. Dopo circa sette giorni di coltura, i fibroblasti migrano dalle cupole della matrice della membrana basale e aderiscono alle placche cellulari, il che può compromettere la crescita ottimale degli organoidi.

Le colture di fibroblasti vengono stabilite dai detriti tissutali recuperati dal filtro. Le cellule migrano fuori dai detriti tissutali e aderiscono alle piastre di coltura.

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