Per iniziare, spegni la luce della stanza. Selezionare Oculare sotto il pannello oculare del software FlowView. Cambia la torretta del cubo in quattro TRITC e spegni il controller del pannello a sfioramento facendo clic su disattiva sotto la retroilluminazione del controller del pannello a sfioramento nel software.
Quindi spegni lo schermo del computer. Aprire il lato anteriore del coperchio in tessuto nero del microscopio. Prendete il piatto con fondo di vetro da 35 millimetri contenente gli embrioni dalla scatola nera e posizionatelo sul tavolino del microscopio.
Quindi accendere l'unità di illuminazione a fluorescenza e utilizzare l'oculare per identificare l'embrione di interesse. Mettilo a fuoco. Chiudere il coperchio in tessuto nero per proteggere il campione dalla luce.
Accendere lo schermo del computer per accedere al software che controlla il microscopio. Modificare l'oculare in LSM nel software per l'acquisizione delle immagini. Eseguire l'ablazione laser in embrioni non stimolati di controllo utilizzando un obiettivo a immersione in acqua con ingrandimento 25x.
Fate clic su Bright Z (Bright Z), Sequence Manager (Gestione sequenze) e Stimolazione LSM (Stimolazione LSM) nella finestra degli strumenti. Impostare il tipo di scanner su Galvano e la dimensione di scansione su 512 per 512. Attivare il canale uno e il canale tre sotto il pannello di impostazione PMT per consentire l'uso del laser a 1040 nanometri e fare clic in tempo reale quattro volte la velocità per visualizzare l'embrione.
Ruotare l'embrione utilizzando la funzione di rotazione per orientare verticalmente l'asse anteriore posteriore e impostare lo zoom su tre. Disegna una regione di interesse o ROI utilizzando lo strumento forma nelle impostazioni di scansione e imposta la dimensione ROI nel pannello di riferimento. Quindi, imposta il ROI su 512 pixel in larghezza e 100 pixel in altezza.
Per impostare i parametri di acquisizione per la pila Z di pre-ablazione, registrare la superficie dell'embrione come zero nella sezione Z. Impostare l'inizio come zero e la fine come 100 micrometri. Impostare la dimensione del passo su due micrometri e attivare la modalità di acquisizione Z selezionando Z nella scheda serie.
Utilizzando la funzione Z luminosa, impostare l'intensità del laser a 1040 nanometri in modo che aumenti linearmente dal 3% al 7%Salvare l'impostazione di imaging corrente come prima attività della pipeline facendo clic su LSM in Sequence Manager. Per impostare i parametri di acquisizione per il filmato pre-ablazione, impostare un ROI di 512 x 512 pixel vicino alla superficie ventrale dell'embrione, come dimostrato in precedenza. Impostare l'intensità del laser a 1.040 nanometri su 3%Tempo di controllo e deselezionare Z sotto il pannello della serie.
Mantieni l'intervallo come corsa libera sotto il pannello time lapse e imposta il ciclo su 10. Salvate l'impostazione corrente come attività successiva della tubazione facendo clic su LSM in Sequence Manager. Per impostare i parametri per l'ablazione laser, definire una regione 3D immediatamente sotto la membrana vitellina.
Impostare l'inizio della pila Z come piano e la fine come 20 micrometri più profonda. Impostare la dimensione del passo su 1,5 micrometri. Attivare il canale due e il canale quattro sotto il pannello di impostazione PMT per consentire l'uso del laser a 920 nanometri.
Impostare l'intensità del laser al 30% e impostare l'acquisizione dell'immagine con il laser per un singolo stack Z all'interno dell'area 3D definita. Salvate l'impostazione corrente come attività successiva della tubazione facendo clic su LSM in Sequence Manager. Per impostare i parametri di acquisizione per il filmato post-ablazione, impostare l'acquisizione dell'immagine per un filmato post-ablazione a 100 fotogrammi singolo piano Z utilizzando i laser da 1, 040 e 920 nanometri.
Impostate l'intensità dei laser su 3% e 0,3%Salvate l'impostazione corrente come attività successiva della pipeline facendo clic su LSM in Sequence Manager. Selezionare la sequenza in acquisire. Modificare il percorso di salvataggio dei dati e il nome del file in base alle esigenze.
Fare clic su pronto e attendere che il software inizializzi la pipeline, quindi fare clic su Avvia per eseguire la pipeline. per eseguire l'ablazione laser negli embrioni stimolati, Impostare i parametri di acquisizione per la pila Z pre-ablazione come dimostrato per gli embrioni non stimolati. Salvate l'impostazione corrente come prima attività della pipeline facendo clic su LSM in Sequence Manager.
Per impostare i parametri per la stimolazione optogenetica all'interno di una ROI definita, modificare lo zoom su uno e selezionare una ROI che copra la superficie ventrale dell'embrione. Spegnere i rilevatori dal canale uno al canale quattro, fare clic su Stimolazione LSM, deselezionare Continua entro la durata e digitare 12 secondi. Salvate l'impostazione corrente come attività successiva della pipeline facendo clic su stimolazione in Sequence Manager.
Impostare un tempo di attesa di tre minuti dopo la stimolazione per garantire l'inattivazione totale della miosina e lo smontaggio apicale della F-actina e ottenere una morfologia tissutale statica prima dell'ablazione laser. Successivamente, impostare i parametri di acquisizione per il singolo filmato di pre-ablazione del piano Z come dimostrato per gli embrioni non stimolati, ad eccezione del fatto che i laser da 1, 040 e 920 nanometri vengono utilizzati per l'acquisizione delle immagini. Accendere i rilevatori dal canale uno al canale quattro.
Impostate l'intensità dei laser su 3% e 0,3%Salvate l'impostazione corrente come attività successiva della pipeline facendo clic su LSM in Sequence Manager. Impostare i parametri per l'ablazione laser come dimostrato per gli embrioni non stimolati. Salvate l'impostazione corrente come attività successiva della tubazione facendo clic su LSM in Sequence Manager.
Impostare i parametri di acquisizione per il singolo film post-ablazione del piano Z come dimostrato per gli embrioni non stimolati. Salvate l'impostazione corrente come attività successiva della tubazione facendo clic su LSM in Sequence Manager. Selezionare la sequenza in acquisire.
Modificare il percorso di salvataggio dei dati e il nome del file in base alle esigenze. Fare clic su pronto e attendere che il software inizializzi la pipeline, quindi fare clic su Avvia per eseguire la pipeline. Negli embrioni non stimolati sottoposti a costrizione apicale, la zucca spaghetti mCherry si è arricchita nella regione apicale mediale, mentre CRY2Rho una mCherry negativa dominante era citosolica.
Negli embrioni stimolati, il segnale mCherry negativo dominante di CRY2Rho è diventato localizzato sulla membrana plasmatica, mentre il segnale apicale mediale di mCherry è completamente scomparso. L'ablazione laser degli embrioni non stimolati all'interno del dominio di costrizione ha portato a un rapido rinculo dei tessuti lungo l'asse anteriore posteriore, mentre l'ablazione laser negli embrioni stimolati non ha provocato un notevole rinculo dei tessuti. L'ablazione è stata quantificata e mostrata qui.
