Per iniziare l'isolamento e la normalizzazione delle proteine reticolate contenenti DNA, aspirare il terreno utilizzando una pipetta di aspirazione dopo il trattamento farmacologico con ubiquitilazione e SUMOilazione. Sciacquare le cellule con PBS ghiacciato prima di aggiungere 600 microlitri di reagente DNAzol. Agitare lentamente la piastra su una piattaforma vibrante per 10 minuti a quattro gradi Celsius e aggiungere 0.3 millilitri di etanolo freddo al 100% direttamente sulla piastra.
Ripetere l'agitazione fino a quando l'aggregato opaco di acido nucleico diventa visibile. Successivamente, trasferire il lisato cellulare in una provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare per 15 minuti a quattro gradi Celsius a 20.000 G.Dopo aver aspirato il surnatante, lavare l'acido nucleico e il pellet proteico reticolato in un millilitro di etanolo al 75%, seguito da due minuti di centrifugazione a 20.000 G e quattro gradi Celsius. Aspirare il surnatante prima di centrifugare alla stessa velocità e rimuovere il liquido rimanente utilizzando una pipetta P-20.
Asciugare il pellet all'aria per cinque minuti. Sciogliere il pellet di acido nucleico essiccato in 0,1 millilitri di acqua bidistillata pipettando su e giù alcune volte. Quindi, incubare la sospensione a 37 gradi Celsius a bagnomaria per 30 minuti fino a quando il pellet si gonfia almeno tre volte.
Sonicare i campioni per 10 secondi utilizzando una sonda con processore a ultrasuoni con un'ampiezza del 30% e quantificare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrometro UV-Vis. Aggiungere acqua bidistillata per regolare la concentrazione del DNA a 400-500 nanogrammi per microlitro in 120 microlitri. Quindi, trasferire 20 microlitri del campione in una nuova provetta per microcentrifuga come controllo del carico di DNA non digerito.
Aggiungere al DNA 2.000 unità gel di nucleasi micrococcica e 11 microlitri di tampone di reazione della nucleasi micrococcica di calcio 10X, disciolti nei restanti 100 microlitri di acqua bidistillata. Incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti.
