Per iniziare il western blotting dei campioni di DNA digerito normalizzato, aggiungere 4X Laemmli sample buffer e far bollire il campione per cinque minuti. Caricare da cinque a sei microgrammi di campione digerito su gel di poliacrilammide dal 4 al 20% ed eseguire SDS-PAGE per risolvere le modificazioni non modificate e post-traduzionali o le DPC coniugate PMT. Incubare il gel con la colorante blu Coomassie per una notte a temperatura ambiente.
Lavare il gel con acqua bidistillata per due ore prima dell'acquisizione dell'immagine. Per rilevare l'ubiquitilazione, la modifica di SUMO-1 o SUMO-2 e 3, la ribosilazione ADP, le DPC totali TOP1, TOP2 alfa o TOP2 beta, diluiscono gli anticorpi corrispondenti come mostrato nella tabella. Successivamente, trasferire il gel in un'appropriata diluizione dell'anticorpo primario nel tampone bloccante e incubare le membrane per una notte a quattro gradi Celsius.
Una volta terminato, incubare la membrana lavata con PBST con un anticorpo secondario diluito 5.000 volte in tampone bloccante per 60 minuti a temperatura ambiente prima di sviluppare la membrana con il reagente di chemiluminescenza potenziato. Acquisire un'immagine utilizzando il sistema di imaging. L'esposizione alla camptotecina ha indotto la formazione di DPC TOP1.
La formazione di DPC TOP1 ha raggiunto il picco dopo 20 minuti di esposizione alla camptotecina, in modo simile alla modifica anti-SUMO-2 e 3. È stato osservato anche il culmine della modificazione e dell'ubiquitilazione di SUMO-1. I DPC e le loro modificazioni SUMO-2 e 3 TOP1 sono diminuiti in modo dose-dipendente dalla camptotecina.
Le DPC TOP2 indotte dagli adipociti e le modifiche di SUMO-2 e 3 hanno raggiunto il picco a 20 minuti e poi sono diminuite. In confronto, le modifiche di SUMO-1 e ubiquitina hanno raggiunto il picco a 60 minuti. Le DPC indotte dalla formaldeide e i loro SUMO-2 e 3, SUMO-1 e ubiquitilazione si sono formati e accumulati in modo dose-dipendente.
La rilevazione quantitativa della PARilazione delle DPC TOP1 utilizzando un anticorpo anti-PAR, la PARilazione TOP1 DPC non è stata rilevabile a meno che non sia stato aggiunto un inibitore PARG alla cellula, suggerendo che la PARilazione traspira prontamente ed è altamente dinamica.
