Per iniziare inoculare 2 milioni di cellule pan02 in 12 millilitri di DMEM e incubare a 37 gradi Celsius e 95% di umidità, 5% di anidride carbonica e 35% di aria. Dopo 48 ore centrifugare la coltura a 28 g per 2 minuti e scartare il surnatante. Fissare le celle aggiungendo 1 millilitro di glutaraldeide al 2,5% nei tubi di microcentrifuga da 1,5 millilitri durante la notte a 4 gradi Celsius.
Il giorno successivo centrifugare i campioni a 1006 g per cinque minuti e aspirare il fissativo prima di risciacquare il campione due volte con PBS molare 0,1. Successivamente, sciacquare i campioni due volte con acqua distillata due volte per 10 minuti ciascuno. Quindi, aggiungere una soluzione da 50 microlitri di tetrossido di osmio all'1% e ferrocianuro di potassio all'1,5% in un rapporto di 1 a 1 e incubare a 4 gradi Celsius per 1 ora.
Centrifugare e sciacquare i campioni due volte con PBS molare 0,1 e una volta con acqua distillata doppia. Quindi aggiungere 1 millilitro di 1% tiocarboidrazide e incubare a temperatura ambiente per 30-60 minuti. Dopo l'incubazione centrifugare e scartare il surnatante prima di sciacquare i campioni 4 volte con acqua distillata doppiamente.
Quindi, aggiungere 50 microlitri di tetrossido di osmio all'1% e lasciarlo fissare a temperatura ambiente per 1 ora. Centrifugare nuovamente e sciacquare i campioni 4 volte con acqua distillata doppiamente. Aggiungere 1 millilitro di acetato di uranile al 2% e lasciare macchiare a 4 gradi Celsius durante la notte.
Dopo aver risciacquato i campioni con acqua distillata doppiamente aggiungere 1 millilitro di soluzione di Walton e incubare a 60 gradi Celsius per un'ora. Dopo l'incubazione sciacquare le cellule 4 volte con acqua distillata doppia prima della disidratazione in una serie di etanolo graduato per 10 minuti ciascuna. Quindi disidratare due volte in un millilitro di acetone al 100% per 10 minuti ciascuno.
Quindi, mescolare 200 microlitri di acetone con resina epossidica Pon 812 in un rapporto di 3 a 1, 1 a 1 e 1 a 3. E immergere i campioni nella resina a temperatura ambiente per 2, 4 e 4 ore rispettivamente Dopo la rispettiva incubazione impregnare i campioni durante la notte in resina epossidica 100% Pon 812. Il giorno dopo, trasferire i campioni in uno stampo piatto e polimerizzarli in un forno a 60 gradi Celsius per 48 ore.
Dopo la polimerizzazione, utilizzando un ultra microtomo, raccogliere strisce affettate in serie di 70 nanometri di spessore sui wafer di silicio idrolizzato e asciugarle in forno a 60 gradi Celsius per 10 minuti.
