Tagliare un nastro di carbonio conduttivo e incollarlo tra i wafer di silicio montati con sezioni di cellule pancreatiche e stadio del campione SEM. Quindi, impostare la tensione di accelerazione FESEM su due kilovolt con una distanza di lavoro di quattro millimetri. Nella barra dei menu in alto, fai clic sull'icona HL.
Quindi, a basso ingrandimento, orientare la prima sezione delle strisce di fette di destinazione e, di nuovo, fare clic sull'icona HL per passare alla modalità di ingrandimento elevato. Raccogli un'immagine appropriata per la struttura di interesse regolando la luminosità, il contrasto e l'ingrandimento dell'immagine. Quindi, selezionare Project View, quindi Open Data e importare i file di immagine da analizzare nel software.
Allineare le immagini facendo clic su Allinea sezioni e Modifica. Quindi, nella barra dei menu in basso a sinistra, regola il valore Intervallo intensità modificando la trasparenza dell'immagine. Selezionare il modulo Estrai sottovolume e fare clic sui set di dati allineati per adattarli alle dimensioni della parte sovrapposta dell'intero stack.
Quindi, nella sottosezione Segmentazione, seleziona Ricampiona, quindi Segmentazione e fai clic su Salva. Quindi, scegli la soglia della bacchetta magica e la dimensione dello strumento pennello per selezionare l'intervallo corretto. Dal menu Selezione, fare clic sull'icona Aggiungi per aggiungere l'area selezionata.
Dopo aver completato la segmentazione regionale, generare un file di immagine seguendo i migliori risultati per le dimensioni dell'oggetto e la risoluzione dell'immagine. Fai clic su Crop Editor e, nella casella Virtual Slider, inserisci il numero sei. Quindi, dal menu a discesa a sinistra, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'area grigia nella sottosezione Progetto e selezionare Genera superficie, quindi Crea e applica.
Nel file generato, usando il modulo Surface View, crea la struttura della superficie e la rappresentazione 3D. Le immagini FESEM 2D rivelano che nel gruppo di controllo, i mitocondri erano distribuiti uniformemente con strutture di creste regolari. Al contrario, il gruppo RSL3 ha mostrato mitocondri rimpiccioliti con maggiore densità di membrana e vaghe strutture cristae.
Tuttavia, non tutte le creste mitocondriali sono degenerate nel gruppo RSL3 poiché alcune sono rimaste intatte. Rispetto al gruppo RSL3, il gruppo inibitore aveva strutture cristae per lo più intatte con solo poche non apparenti. Le immagini 3D del gruppo di controllo hanno fornito una visione più accurata dei mitocondri e delle loro strutture cristae.
Le immagini 3D del gruppo RSL3 hanno mostrato mitocondri irregolari e vacuolati, mentre il gruppo inibitore ha mostrato diverse forme di cristae. La quantificazione delle alterazioni mitocondriali ha mostrato che il gruppo RSL3 aveva significativamente ridotto la lunghezza e il volume mitocondriale, rispetto al gruppo di controllo, mentre il gruppo inibitore ha mostrato risultati intermedi. RSL3 ha anche causato disfunzione mitocondriale e alterato il metabolismo cellulare modificando la morfologia mitocondriale e innescando la ferroptosi.
