Iniziare preparando le soluzioni madre di tutti gli anticorpi a 2.000 microgrammi per millilitro. Quindi, per ciascun anticorpo, etichettare le provette di diluizione con le rispettive concentrazioni, incluso il nome dell'anticorpo. Includere anche una provetta vuota per ogni anticorpo come controllo del veicolo PBS-TBN.
Successivamente, aggiungere 75 microlitri di PBS-TBN a tutte le provette di diluizione degli anticorpi etichettate come 500 microgrammi per millilitro e inferiori, comprese le provette di controllo solo per il veicolo. Per ogni anticorpo, pipettare 150 microlitri della soluzione madre nella provetta etichettata come 1.000 microgrammi per millilitro. Per creare una serie completa di diluizioni per ciascun anticorpo, trasferire 75 microlitri dalla provetta da 1.000 microgrammi per millilitro alla successiva diluizione inferiore della serie.
Successivamente, chiudere il tubo di diluizione appena completato e vorticarlo brevemente. Quindi aggiungere 25 microlitri di anticorpi diluiti nei pozzetti designati di una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti, seguita dall'aggiunta di 25 microlitri di PDL1 umano ricombinante biotinilato a ogni pozzetto di reazione. Coprire la piastra per microtitolazione con un sigillo adesivo in lamina o plastica e incubare a temperatura ambiente per un'ora agitando su un agitatore orbitale a 600 giri/min.
Successivamente, diluire le perle accoppiate PD1 umane ricombinanti a una concentrazione di 50.000 perle per millilitro con PBS-TBN. Rimuovere la piastra di reazione per microtitolazione a 96 pozzetti dall'agitatore e staccare il sigillo della piastra adesiva. Aggiungere 50 microlitri della miscela di microsfere accoppiate PD1 umana ricombinante a ciascun pozzetto.
Sigillare ermeticamente la piastra e incubare per un'ora al buio a temperatura ambiente su un agitatore orbitale impostato a 600 giri/min. Dopo l'incubazione, rimuovere con cautela il sigillo della piastra adesiva. Quindi posizionare la piastra sul separatore magnetico per piastre per due minuti per immobilizzare le perline.
Verificare che il magnete e la piastra per microtitolazione siano collegati saldamente. Capovolgere il piatto e scartare con cura il surnatante. Per lavare i reagenti di reazione in eccesso dalle microsfere, rimuovere la piastra per microtitolazione dal separatore magnetico a piastre e aggiungere 150 microlitri di PBS-TBN a ciascun pozzetto.
Dopo aver rimosso il sigillante e immobilizzato le perle come dimostrato, verificare che il magnete e la piastra per microtitolazione siano fissati e scaricare il surnatante. Aggiungere ora 100 microlitri di soluzione di lavoro SAPE a ciascun pozzetto di reazione e risospendere le perle mediante pipettaggio. Sigillare la piastra e incubarla per un'ora a temperatura ambiente al buio.
Quindi rimuovere con cautela il sigillante adesivo per piastre una volta che le perline sono immobilizzate e il magnete e la piastra sono fissati insieme. Scaricare delicatamente il surnatante capovolgendo la piastra. Per lavare via il SAPE in eccesso dalle perle, rimuovere la piastra per microtitolazione dal supporto magnetico per piastra e aggiungere 150 microlitri di PBS-TBN a ciascun pozzetto per risospendere le perle.
Quindi immobilizzare le microsfere posizionando la piastra per microtitolazione su un separatore magnetico per piastre per due minuti. Dopo aver verificato che il magnete e la piastra per microtitolazione siano fissati, capovolgere la piastra e rimuovere il surnatante. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di immunoglobulina G coniugata anti-umana o anti-coniglio Brilliant Violet 421 diluita nei rispettivi pozzetti.
Sigillare la piastra e incubarla per un'ora al buio a temperatura ambiente. Quindi immobilizzare le perline e rimuovere il sigillante per piastre adesive. Verificare che il magnete e la piastra per microtitolazione siano fissati e scaricare il surnatante.
Lavare gli anticorpi secondari in eccesso dalle perle aggiungendo 150 microlitri di PBS-TBN a ciascun pozzetto per risospendere le perle. Quindi, posizionare la piastra per microtitolazione sul separatore magnetico per piastre per due minuti per immobilizzare le perle. Verificare che il magnete e la piastra per microtitolazione siano saldamente uniti, quindi capovolgere la piastra e scaricare il surnatante.
Una volta rimosso il quarto e ultimo tampone di lavaggio, estrarre la piastra per microtitolazione dal separatore magnetico a piastre. Utilizzando una pipetta, risospendere le microsfere in 100 microlitri di PBS-TBN per pozzetto. Infine, per determinare l'intensità fluorescente mediana di ciascuna reazione, leggere la piastra sul sistema di analisi del flusso a doppio reporter con il volume di aspirazione impostato su 50 microlitri, il numero minimo di microsfere su 100 perle, l'impostazione del timeout su 40 secondi, l'intervallo di gating su 7.000 a 17.000 e la modalità operativa sul doppio reporter.
Tutti e quattro gli anticorpi policlonali anti-PDL1 hanno bloccato l'interazione ricombinante di PDL1 umano con PD1. La percentuale di inibizione dei diversi anticorpi anti-peptide PDL1 variava dal 48% al 74% alla concentrazione massima testata di 1.000 microgrammi per millilitro. L'anticorpo monoclonale di controllo positivo atezolizumab ha raggiunto il 92% di blocco dell'interazione PD1-PDL1 alla concentrazione massima testata di quattro microgrammi per millilitro.
L'analisi comparativa del legame degli anticorpi candidati indotti da PDL1 vax al PDL1 umano ricombinante ha indicato che tutti e quattro gli anticorpi policlonali del peptide anti-PDL1 si sono legati al PDL1 umano ricombinante in modo dipendente dalla concentrazione. L'anticorpo anti-PDL1(130) ha mostrato il più alto segnale di legame RH PDL1 dei quattro candidati anticorpi indotti da PDL1 vax.
