Per iniziare, mantenere le cellule in un pallone di coltura di 75 centimetri quadrati. Aspirare il terreno di coltura e risciacquare le cellule con PBS senza calcio e magnesio. Quindi, aggiungere due millilitri di 0,25% di tripsina EDTA per staccare le cellule di aderenza.
Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente e risospendere le cellule in 10 millilitri di mezzo. Quindi, raccogliere le cellule dal pallone in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Centrifugare a 480 g per cinque minuti a temperatura ambiente e aspirare il fluido.
Risospendere le cellule in 5-10 millilitri di terreno in base alla confluenza originale della coltura. Rimuovere 100 microlitri di celle e aggiungere a un tubo da 1,5 millilitri con 100 microlitri di 0,4% di tripano blu. Aggiungi le cellule all'emocitometro e contale osservando al microscopio e usando il contatore di conteggio manuale.
Diluire le cellule a tre volte 10 alle quarte cellule per millilitro nel terreno di coltura senza rosso fenolo. Aggiungere 2,5 millilitri della sospensione della cella a ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti con coperchio rivestito in poli-D-lisina secondo le indicazioni del produttore. Far crescere le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica in un incubatore umidificato per consentire l'attaccamento delle cellule al vetrino di copertura.
Il giorno successivo, esaminare l'attacco cellulare al microscopio invertito utilizzando un obiettivo 20X. Preparare le soluzioni stock di trattamento alle concentrazioni desiderate e creare un controllo solo fluido, un controllo solo veicolo a una concentrazione che corrisponda al composto in esame e un controllo con lo ionoforo FCCP e i composti di prova. Lavorando con un vetrino alla volta, aggiungere 1,8 millilitri di mezzo per la condizione sotto lo studio alle cellule.
Incubare le cellule trattate con il composto di controllo o di prova a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica in un ambiente umidificato per il tempo desiderato. Dopo il periodo di trattamento, aggiungere 200 microlitri di 10X TMRE alle cellule. Incubare per 15-30 minuti a 37 gradi Celsius in un ambiente umidificato al 5% di anidride carbonica.
Aspirare delicatamente il mezzo e risciacquare le celle due volte con PBS per ridurre al minimo le interferenze di fondo. Quindi capovolgere il vetrino di copertura su un vetrino da microscopio etichettato con le condizioni di trattamento. Immagina che le cellule vivano a 549 nanometri di eccitazione e 575 nanometri di emissione.
Utilizza un microscopio confocale per catturare diversi campi Z-stack con acquisizione di immagini ad alta velocità prima che l'integrità della cella venga persa. Salvare e memorizzare il file di immagine per un'analisi successiva. Le cellule con mitocondri attivi hanno mantenuto la colorazione TMRE e hanno mostrato un'elevata fluorescenza.
I mitocondri depolarizzati o inattivi hanno un ridotto potenziale di membrana, non riescono a trattenere la TMRE e mostrano un basso segnale di fluorescenza.
