Dopo aver clonato il peptide nucleante della vescicola, o tag di sequenza VNP, al terminale amminico della proteina di fusione, coltivare un brodo lisogenico da cinque millilitri, o starter LB, da trasformazioni batteriche fresche a 37 gradi Celsius fino alla saturazione. Quindi, usarlo per inoculare 25 millilitri di brodo terrificante, o TB, contenente un'appropriata selezione antibiotica in un pallone conico da 500 millilitri. Incubare il pallone in un incubatore a 37 gradi Celsius agitando a 200 rotazioni al minuto o superiore a un tiro orbitale di 25 millimetri fino a quando la coltura raggiunge un valore di densità ottica di 600 nanometri, o OD 600, da 0,8 a 1,0.
Quindi, indurre l'espressione proteica ricombinante dal promotore T7 aggiungendo IPTG a una concentrazione finale fino a 20 microgrammi per millilitro o 84 micromolari. Dopo aver concesso tempo sufficiente per l'induzione, pellettare le celle mediante centrifugazione a 3000 G a 4 gradi Celsius per 20 minuti. Far passare il surnatante attraverso un filtro PES sterile e privo di detergente da 0,45 micron per sterilizzare la vescicola contenente il mezzo per la conservazione a lungo termine.
Per concentrare le vescicole in un volume più piccolo, far passare la vescicola sterile contenente il mezzo attraverso un filtro MCE sterile e privo di detergente da 0,1 micron. Quindi, lavare delicatamente la membrana con 0,5-1 millilitro di soluzione salina sterile tamponata con fosfato, o PBS, e utilizzare un raschietto cellulare o uno spargitore di plastica per rimuovere accuratamente le vescicole dalla membrana. Trasferire il concentrato di vescicole in una provetta da microcentrifuga fresca utilizzando una pipetta.
Le vescicole purificate possono essere conservate a quattro gradi Celsius. Sonicare la proteina contenente vescicole nei mezzi sterili utilizzando un programma appropriato per interrompere le membrane lipidiche vescicolari e rilasciare proteine. Centrifugare la sospensione sonicata a 39.000 G e 4 gradi Celsius per 20 minuti per rimuovere i detriti vescicolari.
BL21DE3 Escherichia coli contenente il costrutto di espressione VNp6-mNeongreen ha mostrato fluorescenza mNeongreen indotta durante la notte con IPTG. La fluorescenza è rimasta visibile nella coltura dopo la rimozione delle cellule batteriche mediante centrifugazione. La presenza di VNp-mNeongreen all'interno della coltura in terreni di coltura eliminati è stata confermata dall'elettroforesi su gel di sodio dodecilsolfato poliacrilammide.
Anche le vescicole purificate risospese nella PBS mostravano fluorescenza.
