Inizia preparando un sandwich in gel polimerizzato. Rimuovere i morsetti e gli strati di nastro di carta e rimuovere lentamente il pettine. Sciacquare accuratamente i pozzetti con acqua distillata.
Posizionare correttamente il sandwich di gel nell'apparecchio di elettroforesi verticale. Riempire i serbatoi superiore e inferiore con tampone TBE. Riscaldare le piastre eseguendo una pre-corsa dell'elettroforesi su gel per almeno 30 minuti a 50 watt.
Nel frattempo, sospendere nuovamente i campioni essiccati in cinque microlitri di tampone di caricamento del gel denaturante. Successivamente, utilizzare una piccola siringa riempita con tampone TBE per eliminare l'urea dai pozzetti del gel. Ora carica i campioni nei pozzetti puliti, prendendo nota dell'odore del caricamento.
Far scorrere il gel per due ore a 50 watt o fino a quando il colorante blu bromofenolo non ha esaurito i 2/3 del gel. Dopo l'elettroforesi, spegnere l'alimentazione, rimuovere con cautela il sandwich di vetro e pulire le lastre di vetro. Posizionare il gel in un gel imager per rilevare la fluorescenza delle bande oligonucleotidiche marcate con FAM.
Dopo una, quattro e 15 ore di incubazione, cinque o 50 micromolari Bsep 1 hanno reagito con due campioni micromolari di G4 TBA, TBA a singolo filamento e TBA a doppio filamento. I controlli sono stati caricati per ogni set di campioni. Il substrato G4 TBA ha mostrato un solo addotto di alchilazione a causa della disponibilità di solo G8 per l'alchilazione e la successiva scissione a trefoli.
Sono stati osservati addotti multipli e bande di prodotti di scissione nei TBA a singolo e doppio filamento, perché tutte le guanine erano suscettibili alla reazione di Bsep. La reazione di sondaggio e il tampone tris hanno portato a una mappatura chimica inefficiente a causa della presenza di nucleofili indesiderati, causando una ridotta proprioattività. I campioni G4 TBA hanno mostrato solo la formazione di addotto senza scissione incagliata.
Per il TBA a singolo e doppio filamento, solo un'incubazione di 24 ore ha portato alla frammentazione del DNA, paragonabile alla frammentazione di 15 ore senza Tris.
