Per eseguire l'imaging cellulare vivo del terzo cervello larvale instar, iniziare raccogliendo i cervelli sezionati e i corpi grassi isolati nell'ultimo pozzetto di un piatto di dissezione a tre pozzetti contenente la dissezione e il mezzo di imaging. Posizionare una membrana permeabile al gas sul retro di una diapositiva e premere l'anello diviso al centro. Utilizzando una micro pipetta da 200 microlitri, trasferire fino a 10 cervelli sezionati con il massimo possibile di corpi grassi e da 130 a 140 microlitri del mezzo al centro della membrana.
Orientare il cervello in base alla popolazione di cellule staminali neurali da visualizzare e al tipo di microscopio, assicurandosi che i campioni siano vicini all'obiettivo del microscopio. Ad esempio, per visualizzare le cellule staminali neurali nei lobi cerebrali centrali, assicurarsi che i lobi cerebrali siano più vicini all'obiettivo. Quindi posizionare delicatamente una patina di copertura di vetro sopra la soluzione sulla membrana per diffondere la soluzione con il cervello e i corpi grassi in tutta la membrana.
Tenere il tessuto di laboratorio sul bordo di copertura per asciugare la soluzione in eccesso fino a quando il cervello tocca il vetrino di copertura senza essere schiacciato. Quindi, immobilizzare il vetrino di copertura applicando vaselina fusa lungo i bordi usando un pennello e lasciare che la gelatina si solidifichi. Aggiungi 400 microlitri di mezzo di imaging a un pozzetto in un micro vetrino multi pozzetto.
Trasferisci i corpi grassi precedentemente sezionati in questo pozzo. Quindi, posiziona fino a 10 cervelli in un cluster vicino al centro del pozzo. Orientare il cervello in base alla popolazione di cellule staminali neurali da visualizzare e al tipo di microscopio.
Lascia che il cervello si stabilisca nel pozzo da due a cinque minuti. Coprire il micro vetrino con il coperchio del vetrino prima di trasferirlo al microscopio. Avviare il processo di acquisizione utilizzando la potenza laser e il tempo di esposizione più bassi per ridurre al minimo lo sbiancamento delle foto.
L'imaging di cervelli larvali che esprimono Cherry-Jupiter guidato da UAS e perni etichettati androginamente GFP utilizzando vetrini di imaging multi-pozzetto e senza integrazione di corpi grassi ha rivelato che i perni formavano una mezzaluna apicale pronunciata nel dividere i neuroblasti a cui i fusi mitotici si allineavano costantemente durante la mitosi. In questi campioni, la lunghezza del ciclo cellulare aumentava con l'aumentare del tempo di imaging. I campioni che sono stati ripresi in un mezzo integrato con corpo grasso su un vetrino legato alla membrana non hanno mostrato un aumento della lunghezza del ciclo cellulare.
Inoltre, neuroblasti con quattro divisioni sono stati osservati sul vetrino legato alla membrana di 10 ore.
