Per iniziare, prendete il cervello isolato dai cuccioli di topo soppressi e mettetelo in una capsula di Petri di tre centimetri contenente MEM freddo con EBSS e 2X PSN. In un cannocchiale da dissezione, separare gli emisferi cerebrali, rimuovere e scartare il mesencefalo, l'ippocampo e le meningi. Mettere entrambi gli emisferi corticali in una provetta conica da 50 millilitri contenente cinque millilitri di MEM EBSS con 2X PSN e tenere in ghiaccio.
In una cappa di coltura tissutale, aspirare il terreno dalla provetta conica da 50 millilitri utilizzando una pipetta, lasciando i pezzi di tessuto corticale sul fondo. Aggiungere 10 millilitri di terreno di dissociazione preriscaldato con una pipetta di vetro rivestita e triturare il tessuto da 10 a 20 volte. Trasferire la sospensione in un becher da 50 millilitri contenente una piccola ancoretta e posizionarla su una piastra di agitazione.
Quindi rimuovere il becher, impostarlo a un angolo di 30 gradi per tre minuti per consentire al tessuto di depositarsi e trasferire la sospensione cellulare in un nuovo tubo conico da 50 millilitri su ghiaccio. Centrifugare la provetta conica da 50 millilitri a 1000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Sostituire il surnatante con un terreno di crescita gliale e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
Placcare le cellule a una densità di un milione in piastre trattate con coltura cellulare da 10 centimetri e incubare per 24 ore. Quindi sostituire il terreno con terreno gliale fresco e lasciare che le cellule raggiungano il 100% di confluenza entro due settimane prima di piastrellarle per la sperimentazione. Piastra 100.000 cellule gliali per pozzetto in piastre a sei pozzetti e consenti loro di raggiungere l'80%-100% di confluenza per l'infezione da prioni in vitro.
Esporre omogeneizzati cerebrali diluiti al 20% e PBS alla luce ultravioletta per 30 minuti. Aspirare il terreno dalla glia da infettare e aggiungere da 1,5 a 2 millilitri di terreno di crescita gliale con lo 0,1% di omogenato cerebrale normale o prionico per pozzetto. Dopo 72 ore, rimuovere il terreno, lavare le cellule con PBS e aggiungere nuovi terreni di crescita gliale.
Aspirare con cautela il tessuto adiposo in circa un millilitro di HBSS in soluzione di tripsina allo 0,25%, utilizzando una pipetta sierologica. Trasferire il tessuto in una capsula di Petri di quattro centimetri contenente due millilitri di terreno DMEM F-12 con una miscela di Dnase-1, collagenasi e Dispasi. Quindi tagliare il tessuto adiposo in piccoli pezzi usando le forbici e incubare la miscela a 37 gradi Celsius per 1,5 ore.
Trasferire il tessuto in un tubo conico da 50 millilitri, triturare il tessuto e pellettare la frazione vascolare stromale, che apparirà rossa. Dopo aver lavato il pellet con PBS sterile e aver centrifugato per tre minuti, risospendere il pellet in un millilitro di terreno ADMSC. Successivamente, pipettare la sospensione cellulare attraverso un colino da 40 micrometri in una provetta conica sterile da 50 millilitri, per rimuovere il tessuto non dissociato.
Aggiungere nove millilitri di terreno ADMSC a un piatto trattato con coltura cellulare da 10 centimetri. Pipettare la sospensione cellulare filtrata e incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Cambia il terreno il giorno successivo e fai passare le celle una volta raggiunta la confluenza dall'80% al 90%.
Dopo che le cellule hanno subito due o tre passaggi, risospenderle in 3-10 millilitri di terreno e contare con un emocitometro. Piastra 100.000 cellule per pozzetto in piastre a sei pozzetti contenenti terreni ADMSC e incubazione durante la notte, come mostrato in precedenza. Il giorno successivo, preparare il terreno ADMSC per le cellule stimolate da citochine con 10 nanogrammi per millilitro di TNF-alfa o 200 nanogrammi per millilitro di IFN-gamma.
Creare terreni ADMSC con una concentrazione finale dello 0,1% di omogeneizzato cerebrale infetto da prioni o normale per i campioni di controllo. Aspirare il vecchio terreno, aggiungere 1,5 millilitri di citochina o terreno contenente omogenato cerebrale nei pozzetti corrispondenti in triplice copia e rimettere le piastre nell'incubatore. Quindi lavare le cellule con PBS e isolare l'RNA aggiungendo 350 microlitri di tampone di lisi con l'1% di beta-mercaptoetanolo a ciascun pozzetto.
Rimuovere i lisati cellulari utilizzando un sollevatore cellulare e trascrivere 25 nanogrammi di RNA per campione e amplificare il DNA complementare. Piastra BV2 microglia a 50.000 cellule per pozzetto o glia mista primaria a 100.000 cellule per pozzetto in una piastra a sei pozzetti. Trattare le cellule BV2 con terreni contenenti lo 0,1% di embrione infetto da prioni o omogeneizzato cerebrale normale e incubare per 72 ore.
Dopo l'incubazione, lavare le cellule due volte con PBS per rimuovere l'omogeneizzato cerebrale rimanente. Aggiungere un terreno fresco alle cellule e rimettere la piastra nell'incubatore. Per stimolare gli ADMC, trattarli con 10 nanogrammi per millilitro di TNF-alfa per 24 ore prima di co-coltivarli con BV2 o glia mista.
Lavare tre volte gli ADMC stimolati con PBS e far girare la sospensione ADMSC come dimostrato in precedenza. Sostituire il terreno sulle cellule BV2 o sulla glia mista con due millilitri per pozzetto di terreno ADMSC e posizionare gli inserti per piastre a sei pozzetti con una dimensione dei pori di 0,4 micrometri in metà dei pozzetti. Aggiungere due millilitri di terreno ADMSC a ciascun inserto e aggiungere altri due millilitri di terreno ai pozzetti che non ricevono inserti.
Dopo la pellettatura, la risospensione e il conteggio degli ADMC, aggiungere da 50.000 a 100.000 cellule a ciascun inserto e incubarle. Al termine dell'incubazione, rimuovere e scartare gli inserti o sostituirli in una nuova piastra a sei pozzetti e lavare gli inserti due volte con PBS. Aggiungere il tampone fornito dal kit di isolamento dell'RNA alla glia mista o alle cellule BV2 e raschiare i pozzetti.
