Per rivestire la piastra con EME, diluire EME da 1 a 20 in Advanced DMEM+Per il rivestimento con collagene, diluire cinque milligrammi per millilitro di collagene I in Advanced DMEM+ a 100 microgrammi per millilitro. Rivestire con la piastra con 200 microlitri di EME o collagene diluito per coprire interamente la superficie del pozzetto e incubare per una o due ore a 37 gradi Celsius. Per generare monostrati, aspirare il terreno da una piastra di 35 millimetri contenente organoidi.
Aggiungere un millilitro di PBS e interrompere l'EME nei pozzetti con una punta P1000, pipettando su e giù circa 20 volte per allentare tutto l'EME. Trasferire il contenuto in una provetta conica da 15 millilitri. Aggiungere un millilitro di PBS alla piastra per raccogliere altri organoidi e trasferirli nella stessa provetta conica.
Centrifugare il campione a 350 G per due minuti e rimuovere il surnatante, compresi eventuali residui EME. Quindi, aggiungere un millilitro di soluzione di tripsina al pellet di organoide e incubare a 37 gradi Celsius per due minuti. Pipettare su e giù 10 volte utilizzando un puntale P1000 e aggiungere due millilitri di Advanced DMEM+ per neutralizzare la tripsina.
Centrifugare a 350 g per cinque minuti e aspirare il supernant prima di risospendere il pellet in 4,8 millilitri di rIOM2D. Rimuovere l'EME o il collagene in eccesso in Advanced DMEM+ dai pozzetti. Quindi, aggiungere 200 microlitri di organoidi in rIOM2D e 10 micromolari Y27632 a ciascun pozzetto pre-rivestito.
Dopo 4-16 ore, raccogliere il terreno e centrifugare a 1.000 g per un minuto. Trasferire il surnatante in una nuova provetta conica da 15 millilitri e gettare il pellet. Lavare ogni pozzetto con 300 microlitri di PBS prima di aggiungere 200 microlitri di rIOM2D centrifugato a ciascun pozzetto.
Cambiare il rIOM2D ogni due o tre giorni, sospendendo l'uso dei monostrati Y27632.2D placcati sull'EME prontamente riformati in piccoli sferoidi quando l'EME è stato aggiunto di nuovo alla parte superiore delle celle. Al contrario, un substrato di collagene I era insufficiente per riformare le strutture 3D.