In una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri su ghiaccio, combina 10 microlitri di estratto privo di cellule con quattro microgrammi di DNA plasmidico e 25 microlitri di tampone di sintesi proteica 2X privo di cellule. Preparare fino a un volume totale di 50 microlitri con acqua bidistillata per preparare la soluzione di sintesi proteica priva di cellule. Pesare 0,75 grammi di agarosio e aggiungerlo a 100 millilitri di tampone di acqua bidistillata per preparare lo 0,75% di agarosio.
Cuocere a microonde l'agarosio allo 0,75% in raffiche di 30 secondi ad alta potenza e pipettare 50 microlitri di agarosio fuso in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri o in stampi della forma desiderata. Metti l'agarosio fuso su un blocco termico impostato a 50 gradi Celsius e lascia raffreddare l'agarosio ma non polimerizzare. Quindi, miscelare l'agarosio fuso con la soluzione di sintesi proteica priva di cellule pipettando e mescolando con il puntale della pipetta.
Lasciare raffreddare i gel a temperatura ambiente e polimerizzare per circa due minuti. Trasferire l'agarosio polimerizzato in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri con una spatola e congelare in azoto liquido. Metti gli idrogel congelati a meno 80 gradi Celsius per un'ora.
Successivamente, rimuovere i coperchi delle provette per microcentrifuga. Coprire i tubi con una pellicola di cera e forare la pellicola per consentire all'umidità di asciugarsi. Impostare la temperatura del liofilizzatore a meno 20 gradi Celsius e la pressione a 0,1 millibar e liofilizzare i dispositivi di sintesi proteica senza cellule per 18 ore o per tutta la notte.
Reidratare i dispositivi liofilizzati per 30 minuti con 50 microlitri di acqua bidistillata senza liquidi in eccesso e trasferire i gel su una piastra nera per microtitolazione a 384 pozzetti utilizzando una spatola. Infine, posizionare la piastra per microtitolazione su un lettore di piastre e utilizzare le impostazioni del lettore di piastre mostrate sullo schermo per il rilevamento e l'analisi della fluorescenza. In questa figura è mostrata la sintesi proteica priva di cellule di eGFP e mCherry in un idrogel utilizzando lisati cellulari di E.coli.
I gel di agarosio allo 0,75% sono stati preparati senza stampo di DNA con quattro microgrammi di eGFP o mCherry o con quattro microgrammi di eGFP e mCherry. Viene inoltre mostrata una sovrapposizione dei due canali e la sovrapposizione include l'immagine del contrasto di interferenza differenziale. I risultati hanno confermato la co-espressione di mCherry ed eGFP nell'agarosio.
