Dopo aver clonato il gene di interesse nel plasmide contenente ITR adeno-associato, seminare tre volte 10 fino alla quinta cellula in una piastra a sei pozzetti utilizzando DMEM preriscaldato integrato con il 10% di FBS. Lascia che le cellule crescano a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per raggiungere una confluenza dal 75 al 90%. Successivamente, sciogliere 100 milligrammi di cloridrato di polietilenimmina o PEI max in 100 millilitri di acqua distillata per ottenere un microgrammo per microlitro.
Regolare il pH a 7,1 utilizzando idrossido di sodio. Quindi sterilizzare la miscela utilizzando un filtro da 0,22 micrometri e conservare il reagente per un mese a quattro gradi Celsius. In una provetta da due millilitri, aggiungere 1,3 microgrammi di plasmide rep/cap, 1,3 microgrammi di plasmide contenente ITR e 2,6 microgrammi di plasmide helper adenovirus al DMEM privo di siero.
Il volume totale di questa miscela dovrebbe essere di 100 microlitri. Preparare un controllo negativo in una provetta separata, sostituendo il plasmide rep/cap con un plasmide non correlato. Ora aggiungi 5,2 microlitri di PEI max alla miscela plasmidico.
In questo modo si mantiene un rapporto plasmide/PEI uguale. Frullare delicatamente da 10 a 15 volte su un mixer a vortice impostato su sette. Per più vettori, sfalsare l'aggiunta PEI a intervalli di un minuto per un tempo sufficiente nei passaggi successivi.
Incubare ogni provetta per 15 minuti esatti a temperatura ambiente. Quindi diluire la reazione aggiungendo 1,9 millilitri di DMEM senza siero per ottenere un volume finale di due millilitri. Pipettare delicatamente due volte per miscelare il contenuto.
Aspirare i terreni dal pozzetto. Aggiungere con cautela la miscela di PEI plasmidico ai lati del pozzetto per evitare il distacco delle cellule e incubare le cellule per 72 ore a 37 gradi Celsius e anidride carbonica al 5%. Quindi congelare la piastra di cellule trasfettate per 30 minuti a meno 80 gradi Celsius e scongelare per 30 minuti a 37 gradi Celsius.
Ripetere il ciclo per un totale di tre volte. In una cappa a flusso laminare, miscelare in modo asettico ogni pozzetto mediante pipettaggio per disgregare efficacemente le cellule. Trasferire il lisato in una provetta da due millilitri.
Centrifugare a 15.000 g per 15 minuti a temperatura ambiente per rimuovere i detriti cellulari e trasferire con cura il surnatante in una nuova provetta da due millilitri e conservare la provetta a quattro gradi Celsius. Successivamente, piastrare il tipo di cellula desiderato in una piastra a 96 pozzetti e incubare per una confluenza target compresa tra il 50 e il 75% a seconda della durata della trasduzione. Il giorno seguente, eseguire una serie di diluizioni da una a tre del preparato grezzo in terreni privi di siero per ottenere la quantità ottimale di vettore necessaria per la trasduzione.
Quindi aspirare il terreno dalla piastra a 96 pozzetti e aggiungere da 50 a 100 microlitri di preparato greggio diluito ai pozzetti. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Per determinare l'efficienza di trasduzione, osservare l'espressione del reporter fluorescente utilizzando un microscopio fluorescente a 48 ore dopo la trasduzione.
Per ulteriori analisi, rimuovere il vettore e lavare le celle una volta con PBS preriscaldato. Infine, terminare la trasduzione fissando le cellule in paraformaldeide al 4% per 10 minuti. I dati sull'efficienza di trasduzione hanno suggerito che AAV2 e KP1 erano i sierotipi più potenti in tutte le linee cellulari testate.
HEPA1-6 ha mostrato una marcata diminuzione della trasduzione rispetto a Huh7. AAV2 ha trasdotto in modo efficiente i mioblasti HSKMC indifferenziati e i miotubi HSKMC differenziati. Le diverse condizioni dei fluidi giocano un ruolo importante durante la trasduzione.
Gli organoidi dell'intestino tenue di topo coltivati in terreni di pre-trasduzione sono stati trasdotti in modo meno efficace rispetto a quelli coltivati in terreni di crescita organoidi.
