Posizionare gli ovociti di vescicola germinale (GV) di controllo e trattati con etoposide in diverse piastre di coltura di tessuti plastici con tampone PFA-Tx 100 per 40 minuti a temperatura ambiente. Sciacquare gli ovociti in tre tamponi di lavaggio distinti da 50 microlitri a temperatura ambiente e metterli in 25 microlitri di tampone bloccante su un blocco caldo per un'ora. Successivamente, preparare l'anticorpo primario che riconosce gamma H2AX.
Diluire l'anticorpo primario con il tampone bloccante in un rapporto di uno a 200 e immergere gli ovociti in gocce da 15 microlitri a quattro gradi Celsius durante la notte. Lavare gli ovociti in tre diversi tamponi di lavaggio da 50 microlitri. Preparare l'anticorpo secondario anti-coniglio a crescita coniugata Alexa Fluor 488.
Dopo averlo diluito con il tampone bloccante, immergere gli ovociti in gocce da 15 microlitri dell'anticorpo per un'ora su un blocco caldo a 37 gradi Celsius al riparo dalla luce. Prendi un colorante di DNA fluorescente rosso lontano DRAQ7 e trasferisci gli ovociti su di esso per 10 minuti a temperatura ambiente al buio prima di lavarli con tre diversi tamponi di lavaggio. Aggiungere piccole gocce di tampone di lavaggio agli ovociti in una capsula di Petri con fondo in vetro da 35 millimetri per microscopia confocale.
Accendere il controller laser e i laser nel sistema confocale. Dopo aver acceso il controller del microscopio e le lampade, apri il software confocale e scegli la lente a olio 40X. Posizionare la capsula con gli ovociti nel portacampioni e cercare di mettere a fuoco gli ovociti spostando il tavolino sugli assi X, Y e Z utilizzando il joystick.
Impostare la potenza del laser, il guadagno e la dimensione del foro stenopeico in modo indipendente per ogni esperimento per ridurre al minimo la saturazione. Per ogni ovocita, impostare l'area di interesse in modo specifico nel nucleo nell'area del DNA. Definisci i bordi dell'area del DNA e regola la dimensione del passo Z a tre micrometri.
Quindi avviare la scansione. Salvare le immagini per ogni cella della cartella selezionata. Aprire il software ImageJ e fare clic sull'immagine, seguita dal colore e dai canali divisi.
Per dividere tutti i canali. Fare clic sulla tabella di ricerca e scegliere i colori preferiti per ciascun canale Fare clic su immagine, colore e unisci canali per unire i canali per gamma H2AX e DNA. Negli ovociti nucleolici circondati con alti livelli di danno al DNA, fare clic su immagine, pile, Z-project e, con il comando di selezione a mano libera, selezionare l'intera area del DNA.
Fare clic su analizza, seguito da misura per misurare la fluorescenza gamma H2AX e copiare le misurazioni in un file Excel. In questa figura è mostrata la fluorescenza gamma H2AX negli ovociti dello stadio GV del nucleolo circondato zero ore dopo il trattamento con etoposidi. Il gamma H2AX aumenta immediatamente dopo l'esposizione a tutte le concentrazioni di etoposide e l'aumento è dipendente dalla concentrazione.
La fluorescenza gamma H2AX negli ovociti dello stadio GV del nucleolo circondato 20 ore dopo il trattamento con etoposide è mostrata qui. Gamma H2AX si riduce 20 ore dopo l'esposizione a tutte le concentrazioni di etoposide. Dopo un arresto prostrutturato prolungato, gli ovociti dello stadio GV hanno mostrato la capacità di ridurre il numero e l'intensità dei focolai gamma H2AX, il che implica la presenza di processi di riparazione attivi negli ovociti arrestati dello stadio GV.
