Per iniziare, indossa dispositivi di protezione individuale, tra cui protezione per gli occhi, una maschera chirurgica e guanti non in lattice. Preparare 20 millilitri di neuroblastoma di topo o cellule BHK-21 a una concentrazione di 3,0 volte 10 al quinto cellula per millilitro in EGM. Tenere le celle preparate fredde fino a quando non sono pronte per l'uso.
Successivamente, preparare il virus CVS-11 diluendolo in EGM. Assicurarsi di mantenere il virus preparato freddo fino al momento dell'uso. Pulire la camera dei vetrini di umidità e i vetrini per microscopio rivestiti in politetrafluoroetilene con etanolo al 70% e lasciarli asciugare all'aria nell'armadio di biosicurezza.
Dopo la pulizia, aggiungere acqua distillata alle strisce di carta assorbente nella camera dei vetrini per garantire un'umidità costante durante tutta la procedura. Utilizzando una matita, etichettare ogni vetrino con le informazioni di identificazione richieste, come il numero di lotto, la data e il tipo di cella. Posizionare i vetrini etichettati nella camera dei vetrini per la conservazione.
Quindi applicare 50 microlitri di diluizione virale ai pozzetti sui vetrini del microscopio utilizzando una pipetta ripetitiva. Applicare 50 microlitri di diluizione cellulare su ciascun pozzetto, facendo attenzione a non contaminare il puntale della pipetta con il virus già presente nel pozzetto. Successivamente, chiudere la camera del vetrino di umidità e posizionarla nell'incubatrice umida a una temperatura compresa tra 34 e 36 gradi Celsius.
Successivamente, rimuovere il vetrino dalla camera di umidità e aspirare meticolosamente il surnatante. Lavare il vetrino per due minuti in un barattolo di coplin pieno PBS, quindi lasciarlo asciugare all'aria. Mettere il vetrino in un barattolo di coplin freddo riempito di acetone per fissare il campione.
Metti il barattolo in un congelatore a meno 20 gradi Celsius approvato per materiali infiammabili per almeno un'ora. Una volta che l'acetone evapora e il vetrino si asciuga, applicare l'anticorpo fluorescente diretto antirabbico coniugato ai pozzetti del vetrino e incubare il vetrino per 30 minuti in un'incubatrice umida a 34-36 gradi Celsius. Quindi lavare il vetrino due volte in un barattolo di plastica comune per due minuti ciascuno.
Asciugare il vetrino all'aria e montare il vetrino coprioggetto con il triss 0,05 molare e cloruro di sodio 0,15 molari in montante di glicerolo al 20%. Utilizzare un microscopio a fluorescenza con un ingrandimento di 200 volte per valutare l'infettività cellulare. Quindi, rimuovere i vetrini rimanenti dall'incubatrice e dalla camera di umidità.
Aspirare con cura il surnatante da ogni pozzetto. Quindi mettere i vetrini in un barattolo di coplin con PBS per uno o due minuti. Lasciare asciugare i vetrini all'aria per circa 30 minuti e poi conservarli a meno 80 gradi Celsius fino all'uso.
