Per iniziare, preparare la diluizione sui campioni di siero o di liquido cerebrospinale del paziente per il test. Preparare il coniugato richiesto alla concentrazione di lavoro appropriata diluendolo in PBS con 0,05% di Evans Blue. Per i test anticorpali fluorescenti indiretti, recuperare il numero appropriato di vetrini antigenici preparati necessari per il test.
Lasciare che i vetrini si scongelino e si asciughino completamente. Quindi, metti i vetrini in un barattolo Coplin pieno di acetone e trasferiscili in un congelatore a meno 20 gradi Celsius approvato per materiali infiammabili per due ore o tutta la notte. Successivamente, rimuovere i vetrini dall'acetone e lasciarli asciugare all'aria.
A questo punto, posizionare i vetrini nella scatola della camera di umidità all'interno dell'armadio di biosicurezza. Per mantenere l'umidità, aggiungere strisce assorbenti imbevute di acqua distillata nella camera. Applicare 50 microlitri di ciascun campione di controllo, diluizione del campione o PBS al pozzetto predeterminato.
Posizionare la camera chiusa del vetrino di umidità a 37 gradi Celsius, 5% di umidità di anidride carbonica per 30 minuti. Una volta terminato, rimuovere la camera di scorrimento dell'umidità dall'incubatrice e trasferirla in una cabina di biosicurezza. Utilizzando una punta di aspirazione, aspirare con cautela il surnatante da ciascun pozzetto senza disturbare il monostrato cellulare.
Successivamente, applicare una goccia di PBS su ciascun pozzetto utilizzando una pipetta contagocce sterile. Aspirare con cura il PBS e trasferire ogni vetrino in un barattolo Coplin riempito di PBS. Quindi riposizionare i vetrini nella scatola della camera di umidità.
Applicare 50 microlitri del coniugato anticorpale anti-umano appropriato su ciascun pozzetto e incubare per 30 minuti in un'incubatrice umida. Al termine dell'incubazione, trasferire la camera di umidità in una cabina di biosicurezza. Aspirare il surnatante utilizzando una punta di aspirazione.
Successivamente, applicare una goccia di PBS su ciascun pozzetto utilizzando una pipetta contagocce sterile. Dopo aver rimosso il PBS, lavare il vetrino due volte in un barattolo Coplin di PBS per un totale di 15 minuti. Una volta lavati, lasciare asciugare i vetrini all'aria, quindi montare un vetrino coprioggetto con il supporto di montaggio.
Prendete i vetrini e leggeteli al microscopio a fluorescenza. Classificare i campioni da negativi a quattro più con campioni negativi che non mostrano fluorescenza e quattro campioni più che mostrano una fluorescenza verde brillante. Assegnare i campioni e il valore dell'endpoint rappresentato dal fattore di diluizione in corrispondenza del quale il campione visualizza un grado più di uno o due.
Dopo la vaccinazione iniziale, sono stati osservati alti livelli di immunoglobuline M e G nei campioni dei pazienti. Circa sei mesi dopo la vaccinazione, nei campioni dei pazienti erano presenti livelli significativamente più bassi di entrambi gli anticorpi, ma i livelli di immunoglobuline M erano diminuiti quasi completamente. 18 mesi dopo la vaccinazione, gli anticorpi contro le immunoglobuline M non sono stati rilevati nei campioni dei pazienti.
I livelli di immunoglobulina G sono persistiti e sono rimasti come quelli rilevati a sei mesi dopo la diminuzione iniziale rispetto al periodo di due settimane.
