Preparare due provette di perline di ceramica riempiendo una provetta PCR da due millilitri con una provetta da circa 200 microlitri piena di perline di ceramica da 1,4 millimetri ed etichettare la provetta di conseguenza prima di trasferirle all'interno del cappuccio sterile. Aggiungere il volume raccomandato di tampone di lisi fornito nel kit di estrazione dell'RNA alla provetta PCR etichettata. Prelevare circa un cubo di tre millimetri dal campione di cervello confermato con infezione da rabbia utilizzando un applicatore di legno e metterlo in una provetta etichettata con l'ID del campione e 100 microlitri di acqua priva di nucleasi nella provetta etichettata come controllo negativo.
Distruggi manualmente il tessuto cerebrale utilizzando un bastoncino applicatore di legno e poi vortica alla massima velocità fino a raggiungere la completa omogeneizzazione del tessuto. Successivamente, centrifugare il lisato omogeneizzato. Trasferire il surnatante in una provetta da microcentrifuga appena marcata utilizzando una pipetta e utilizzarlo per ulteriori fasi di estrazione dell'RNA, preparazione del CDNA e amplificazione PCR.
Dopo la preparazione del CDNA e l'amplificazione della PCR utilizzando i pool di primer A e B, eseguire la pulizia e la quantificazione della PCR nell'area post-PCR. Le microsfere Aliquot SPRI vengono inserite in provette da microcentrifuga dal flacone principale. Questi possono anche essere preparati in anticipo.
Conservare le provette a quattro gradi Celsius o conservarle in una griglia fredda o con ghiaccio. Successivamente, riscaldare l'aliquota del microfono SPRI a circa 20 gradi Celsius e vorticare accuratamente per risospendere il cordone nell'intera soluzione. Quindi, nelle provette da 1,5 millilitri, combinare i prodotti PCR del pool di primer A e del pool di primer B per ciascun campione.
Aggiungere acqua per portare il volume a 25 microlitri, se necessario, prima di aggiungere 25 microlitri di perle SPRI a ciascun prodotto combinato e mescolarlo. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 10 minuti con occasionali capovolgimenti o movimenti delle provette. Successivamente, posizionare le provette su una griglia magnetica fino alla separazione delle perline e della soluzione.
Una volta fatto, scartare il surnatante senza disturbare il pellet di perline. Quindi eseguire due lavaggi di 30 secondi utilizzando 200 microlitri di etanolo all'80% appena preparati e scartare l'etanolo. Dopo il secondo lavaggio, rimuovere tutte le tracce di etanolo utilizzando un puntale per pipette da 10 microlitri.
Asciugare il pellet all'aria fino a quando le tracce di etanolo non sono evaporate e il pellet passa da lucido a opaco. Risospendere le perle in 15 microlitri di acqua priva di nucleasi per recuperare il prodotto DNA pulito e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Separare le perline dalla soluzione su una rastrelliera magnetica.
Dopo aver trasferito il surnatante in una nuova provetta da 1,5 millilitri, preparare una diluizione da 1 a 10 di ciascun campione in acqua priva di nucleasi. Misurare la concentrazione di DNA di ciascun campione diluito con un fluorimetro altamente sensibile e specifico, seguendo le istruzioni del produttore.
