Iniziare l'adescamento e il caricamento della cella di flusso di qualità controllata capovolgendo il coperchio del dispositivo di sequenziamento e facendo scorrere il coperchio della porta di adescamento in senso orario, visualizzando la porta di adescamento. Per rimuovere le bolle d'aria, impostare una pipetta P 1000 a 200 microlitri e inserire il puntale della pipetta verticalmente nella porta di adescamento. Ruotare la rotella fino a quando non si vede un piccolo volume che entra nel puntale della pipetta.
Caricare 800 microlitri di miscela di adescamento della cella di flusso pre-preparata nella cella di flusso tramite la porta di adescamento per evitare l'introduzione di bolle. Sollevare il coperchio della porta del campione e caricare 200 microlitri della miscela di adescamento rimanente nella cella di flusso attraverso la porta di adescamento. Per garantire la miscelazione delle perle di caricamento, risospendere la miscela master della libreria mediante pipettaggio e a goccia, caricare 75 microlitri nella cella di flusso tramite la porta del campione.
Riposizionare delicatamente il coperchio della porta del campione assicurandosi che il tappo entri nella porta del campione. Chiudere la porta di adescamento e riposizionare il coperchio del dispositivo di sequenziamento. Per le chiamate in tempo reale, usa Rampart.
Utilizzare l'ambiente Arctic RabV e lavorare nella directory creata per l'output Rampart. Digitare quindi il comando Rampart per passare ai percorsi richiesti. Innanzitutto, il protocollo dello schema specifico di Rampart e la base successiva chiamata path, la cartella di output mino fastq pass per l'esecuzione.
Aprire una finestra del browser e passare all'host locale 3000 nella casella URL. Attendere che vengano chiamati dati di base sufficienti prima che i risultati vengano visualizzati sullo schermo. I tre pannelli superiori mostrano i grafici di riepilogo per l'intera corsa.
Il grafico uno mostra la profondità di copertura delle letture mappate per ogni codice a barre per posizione nucleotidica sul genoma di riferimento dell'indice. Il grafico due mostra le letture mappate da tutti i codici a barre nel tempo e il grafico tre mostra le letture mappate per codice a barre. I pannelli inferiori mostrano le righe di grafici per codice a barre.
A sinistra mostra la profondità di copertura delle letture mappate per posizione nucleotidica sul genoma di riferimento dell'indice. La distribuzione della lunghezza delle letture mappate si trova nel mezzo. Nell'angolo destro è riportata la proporzione di posizioni nucleotidiche sul genoma di riferimento dell'indice che ottiene una copertura di 10x, 100x e 1000x delle letture mappate nel tempo.
Per l'assegnazione del lignaggio delle sequenze di consenso, usa MadDog. Estrarre il repository MadDog da GitHub per assicurarsi di lavorare con la versione più recente. Crea una cartella all'interno del repository MadDog locale creato in precedenza.
All'interno della cartella, aggiungi il file fastA contenente le sequenze di consenso. Inoltre, aggiungere un file di metadati alla cartella. Assicurati che questo file sia un file CSV con quattro colonne denominate ID, paese, anno e assegnazione.
Estrarre il repository MadDog da GitHub per assicurarsi di lavorare con la versione più recente. Nell'interfaccia della riga di comando, attivare l'ambiente conda con un comando conda activate MADDOG. Nell'interfaccia della riga di comando, vai alla cartella del repository MadDog.
Innanzitutto, eseguire l'assegnazione della derivazione sulle sequenze per verificare la presenza di potenziali anomalie e identificare se l'esecuzione del passaggio di designazione della derivazione più lungo è appropriata eseguendo l'assegnazione sh. sh comando. Quando richiesto, immettere Y per confermare che il repository è stato estratto e funziona con l'ultima versione di MadDog.
Quando richiesto, immettere il nome della cartella contenente il file fastA all'interno del repository MadDog. Al termine dell'assegnazione della derivazione, controllare il file di output nella cartella. Se l'output è quello previsto e più sequenze sono assegnate alla stessa derivazione, eseguire la designazione della derivazione.
Durante l'esecuzione della designazione di derivazione, eliminare il file di output dell'assegnazione appena creato. Nel terminale all'interno della cartella del repository MadDog, eseguire il comando sh designation.sh. Quando richiesto, immettere Y per indicare che il repository è stato estratto e che il lavoro viene eseguito con la versione più aggiornata di MadDog.
Quando richiesto, immettere il nome della cartella all'interno della cartella del repository MadDog contenente il file fastA e i metadati. Il flusso di lavoro dal campione alla sequenza per l'interpretazione del virus della rabbia RABV è stato utilizzato con successo in diverse condizioni di laboratorio in paesi endemici come Tanzania, Kenya, Nigeria e Filippine. La chiamata di base in tempo reale utilizzando Rampart ha mostrato la generazione in tempo reale delle letture e la copertura percentuale per campione.
Un sistema di classificazione e nomenclatura del lignaggio, MadDog, utilizzato per compilare e interpretare le sequenze RABV risultanti, ha mostrato la classificazione a più alta risoluzione dei lignaggi locali dopo l'assegnazione di MadDog.
