Per iniziare, preparare l'apparecchiatura accendendo il respirometro ad alta risoluzione e collegarlo al software di respirometria VatLab per l'acquisizione e l'analisi dei dati. Sostituire l'etanolo al 70% nella camera ossigrafica con acqua bidistillata. Utilizzando un'ancoretta magnetica, agitare continuamente a 750 giri/min nella camera.
Lasciate riposare per 10 minuti e poi aspirate l'acqua. Lavare la camera tre volte con acqua bidistillata per cinque minuti ciascuna. Per calibrare i sensori di ossigeno, rimuovere prima l'acqua bidistillata e pipettare due millilitri del mezzo di preparazione delle cellule nella camera.
Posizionare i tappi lasciando una bolla di ricambio d'aria. Per registrare i valori di calibrazione dell'ossigeno, regolare le impostazioni come il guadagno per il sensore, la tensione di polarizzazione e l'intervallo di registrazione dei dati. Quindi etichettare l'esperimento e inserire il mezzo.
Fare clic sul layout e selezionare 01 Calibration Experiment GR3 Temp. Agitare il fluido con l'ancoretta a 750 giri/min per almeno 30 minuti a 37 gradi Celsius e monitorare le prestazioni della membrana del sensore. Tenendo premuto il tasto sinistro del mouse e il tasto Maiusc, trascinare il mouse per selezionare un'area in cui la variazione della concentrazione di ossigeno è stabile.
Quindi fare clic su ossigrafo e quindi su Calibrazione O2. Nella calibrazione dell'aria, modificare il contrassegno selezionato nella regione selezionata in precedenza. Quindi fare clic su calibra e copia negli appunti.
Interrompi la registrazione e salva cliccando sull'ossigrafo. Seguito da OK Control e quindi salvare e disconnettere. Successivamente, per eseguire la valutazione respiratoria, aprire la camera e aspirare il mezzo all'interno.
Caricare gli spermatozoi in un volume finale di due millilitri di MRM per l'analisi delle cellule permeabilizzate. Caricare la calibrazione facendo doppio clic sulla casella del calib POS nell'angolo in basso e aprendo la calibrazione eseguita in precedenza. Quindi interrompi l'esperimento.
Iniettare 4,5 microlitri di digitonina 10 millimolari e permeabilizzare le cellule per cinque minuti. Registrare la respirazione delle cellule intatte per almeno cinque minuti fino a quando non si ottiene un segnale stabile. Quindi aggiungere i substrati per il complesso I o il complesso II.Misurare il consumo di ossigeno fino a quando il segnale non aumenta e si stabilizza.
Successivamente, iniettare cinque microlitri di ADP 0,5 molare e misurare il consumo di ossigeno fino a quando il segnale non aumenta e si stabilizza. Aggiungi un microlitro di quattro milligrammi per millilitro di oligomicina, che è un inibitore dell'ATP sintetasi. Misurare il consumo di ossigeno fino a quando il segnale diminuisce e si stabilizza.
Titolare aggiungendo un microlitro di FCCP in fasi successive, partendo da 0,1 millimolari a un millimolare fino a raggiungere una frequenza respiratoria massima disaccoppiata. Misurare il consumo di ossigeno fino a quando il segnale non aumenta e si stabilizza. Interrompere l'iniezione del farmaco quando il consumo di ossigeno inizia a diminuire.
Infine, iniettare un microlitro di un rotenone millimolare per il complesso I o cinque millimolari di antimicina A per il complesso II per discriminare tra il consumo di ossigeno mitocondriale e residuo. Misurare il consumo di ossigeno fino a quando il segnale diminuisce e si stabilizza. Per eseguire l'analisi dei dati, selezionare le regioni in cui il flusso di ossigeno per volume correlato è stabile dopo l'iniezione di un substrato o di un inibitore, fare clic sugli indicatori, quindi sulle finestre delle statistiche ed esportare i dati.
Normalizza i dati ottenuti per 1 milione di spermatozoi e sottrai il consumo di ossigeno non mitocondriale da tutti i valori. Calcola gli indici usando queste equazioni. È stata ottenuta una registrazione di spermatozoi intatti da un campione di sperma in cui la linea blu mostrava la concentrazione di ossigeno e la linea rossa rappresentava il flusso di ossigeno per volume correlato.
Un numero inferiore di spermatozoi ha portato a un minore consumo di ossigeno al basale. Inoltre, utilizzando questo protocollo sono state ottenute curve di consumo di ossigeno specifiche per il complesso mitocondriale I o il complesso II.
