Per iniziare, centrifugare FBS per una notte in un'ultracentrifuga a 110.000 G e quattro gradi Celsius per rimuovere le sEV endogene. Sterilizzare il surnatante filtrandolo attraverso una membrana di ultrafiltrazione da 0,2 micron per ottenere FBS privi di sEV. Successivamente, in un piatto di coltura da 150 millimetri, placcare circa 3 volte 10 al settimo macrofagi derivati dal midollo osseo immortalati in 20 millilitri di terreno di coltura DMEM.
Incubare la capsula a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica durante la notte prima di raccogliere le vescicole extracellulari dai macrofagi. Il giorno successivo, dopo aver scartato il terreno, lavare le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato o PBS. Sostituire il terreno con DMEM contenente il 10% di siero fetale bovino libero privo di vescicole extracellulari prima di incubare le cellule a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica.
In base ai requisiti dell'esperimento, raccogliere e trasferire il surnatante delle cellule in provette da centrifuga da 50 millilitri. Centrifugare le provette a 300 G per 10 minuti per rimuovere le cellule. Trasferire il risultato del surnatante da ciascuna provetta a una nuova provetta da centrifuga da 50 millilitri e scartare il pellet.
Questa volta, centrifugare il surnatante a 2000 G per 10 minuti per rimuovere le cellule morte. Quindi trasferire il surnatante in nuove provette da centrifuga ad alta velocità e scartare i pellet. Successivamente, per rimuovere detriti e microvescicole, centrifugare il surnatante ottenuto a 10.000 G per 30 minuti utilizzando una centrifuga ad alta velocità.
Trasferire il surnatante risultante in nuove provette per ultracentrifuga aggiungendo 35 millilitri in ciascuna provetta e scartando i pellet. Centrifugare le provette dell'ultracentrifuga in una centrifuga a rotore a secchiello oscillante a 110.000 G per 70 minuti prima di scartare il surnatante. Lavare il pellet grezzo arricchito con sEVs risultante con un millilitro di PBS.
Anche in questo caso, aggiungere un millilitro di PBS al pellet lavato in una delle provette e mescolare pipettando continuamente. Trasferire il millilitro di sospensione PBS risultante in un'altra provetta contenente il pellet e ripetere la stessa operazione fino a quando tutti i pellet nelle provette non sono miscelati mediante pipettaggio. Trasferire il millilitro risultante di PBS ricco di sEV in una nuova provetta per ultracentrifuga.
Quindi centrifugare la nuova provetta in un'ultracentrifuga da tavolo a 110.000 g per 70 minuti. Dopo aver scartato il surnatante, lavare il pellet grezzo arricchito con sEV risultante con 100 microlitri di PBS. Aggiungere 1,2 millilitri di soluzione di preparazione proteica in una provetta proteica standard per sciogliere i 30 milligrammi di BSA presenti in essa.
Diluire la soluzione standard proteica risultante con PBS per ridurne la concentrazione da 25 a 0,5 milligrammi per millilitro. Aggiungere otto diversi volumi della soluzione proteica standard diluita nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti e portare il volume a 20 microlitri in ciascun pozzetto utilizzando PBB. Aggiungere 18 microlitri di tampone di lisi HEPES ai pozzetti del campione, seguiti dall'aggiunta di due microlitri dei campioni di sEVs.
Successivamente, aggiungere 200 microlitri di soluzione di lavoro BCA preparata secondo le istruzioni del produttore in ciascun pozzetto. Lasciare riposare la piastra a temperatura ambiente per 20-30 minuti. Infine, misurare l'assorbanza a 562 nanometri utilizzando un lettore per micropiastre.
Calcolare il contenuto proteico totale nelle sEV utilizzando i risultati ottenuti. Le immagini al microscopio elettronico a trasmissione delle sEV isolate hanno mostrato una tipica morfologia a coppa. L'analisi del tracciamento delle nanoparticelle ha mostrato che le sEV isolate erano per lo più concentrate a 136 nanometri.
Il Western blot ha mostrato che le sEV isolate erano significativamente arricchite di marcatori di sEVs, tra cui CD9, beta-actina e TSG101. Il marcatore del reticolato endoplasmatico GRP94 è stato rilevato solo nel lisato a cellula intera. I risultati hanno indicato che il metodo utilizzato ha prodotto sEV con un alto livello di purezza.
