Centrifugare le cellule satelliti isolate da FACS ed eliminare il surnatante. Lavare le cellule con un millilitro di PBS, centrifugarle e incubarle in un tampone di estrazione nucleare a freddo da un millilitro su ghiaccio per 20 minuti. Aggiungere 20 microlitri di microsfere magnetiche rivestite di Concanavalin A in una provetta da 1,5 millilitri contenente 850 microlitri di tampone di legame a freddo.
Quindi, utilizzando una griglia magnetica, lavare le perline due volte con un millilitro di tampone per legatura a freddo e lasciare che le perline si accumulino sul lato della provetta sulla griglia per cinque minuti prima di risospenderle delicatamente in 300 microlitri di tampone per legatura a freddo. Successivamente, centrifugare i nuclei e risospenderli delicatamente in 600 microlitri di tampone di estrazione nucleare. Quindi mescolare 600 microlitri di nuclei estratti con 300 microlitri di liquame di Concanavalin A e incubare a quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Dopo aver rimosso il surnatante utilizzando un rack magnetico, risospendere i nuclei legati alle microsfere con un millilitro di tampone di blocco del freddo. Anche in questo caso, rimuovere il surnatante e lavare due volte i nuclei legati alle perline con un millilitro di tampone di lavaggio a freddo. Separare il surnatante, risospendere delicatamente i complessi di microsfere del nucleo con un anticorpo primario specifico e incubare a quattro gradi Celsius per una notte con una leggera agitazione.
Il giorno successivo, rimuovere il surnatante e lavare i nuclei legati alle microsfere prima di risospenderli in 100 microlitri di tampone di lavaggio a freddo. Aggiungere 100 microlitri di nucleasi A-micrococcica della proteina A-diluita ai 100 microlitri di nuclei legati alle perle e incubare a quattro gradi Celsius per un'ora con agitazione. Dopo l'incubazione, rimuovere il surnatante e lavare due volte i nuclei legati alle microsfere prima di risospenderli in 150 microlitri di tampone di lavaggio a freddo.
Successivamente, aggiungere tre microlitri di cloruro di calcio 100 millimolari, mescolare rapidamente agitando e incubare su ghiaccio per 30 minuti. Arrestare la reazione aggiungendo 150 microlitri di tampone di arresto e incubare a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Centrifugare i campioni e trasferire il surnatante in una nuova provetta per microcentrifuga, scartando il pellet e le perle.
Quindi aggiungere tre microlitri di sodio dodecil solfato al 10% e 2,5 microlitri di proteinasi K.Mescolare per inversione e incubare per 10 minuti a 70 gradi Celsius. Quindi aggiungere 300 microlitri di fenolo: cloroformio: alcol isoamilico e vortice prima di trasferire in provette a blocco di fase da due millilitri. Centrifugare e aggiungere 300 microlitri di cloroformio nella stessa provetta.
Centrifugare di nuovo e raccogliere il surnatante in una provetta da 1,5 millilitri. Quindi, aggiungi un microlitro di glicogeno, quindi 750 microlitri di etanolo al 100% e lascia che il DNA precipiti durante la notte a meno 20 gradi Celsius. Il giorno successivo, pellettizzare il DNA mediante centrifugazione, quindi lavare il pellet con un millilitro di etanolo al 100% e centrifugare due volte prima di rimuovere l'etanolo residuo con una pipetta.
Asciugare il pellet all'aria per cinque minuti e risospenderlo in 25 microlitri di tampone tris-EDTA. L'H3KME2 e il H3K27AC sono stati arricchiti attorno ai TSS di PAC7, ITGA7, LAM2, CXCR4 e VCAM1. Tuttavia, H3K4ME2 e H3K27AC non sono stati arricchiti in quelli di ITGAM, PTPRC, PECAM, CKM o MHY3.
Quasi nessun segnale è stato ottenuto con il campione di IgG. Vengono mostrati l'analisi dei motivi noti di HOMER, i picchi AR e le cellule satelliti e le regioni percentuali mirate. L'analisi dei cercatori ha svelato quasi 500 picchi con un punteggio di picco superiore a 50, di cui più di 200 con un punteggio superiore a 100.
