Per preparare una barra per la testa a forma di omega per il poggiatesta zebrafish, attacca un pezzo di argilla da modellare a base di olio a un micromanipolatore a tre assi. Quindi inserire un braccio della barra per la testa nell'argilla e orientare la barra per la testa orizzontalmente. Prepara il cannone per tenere in posizione il corpo del pesce durante l'intervento chirurgico.
Per rimuovere la pelle e l'acqua in eccesso dai siti di attacco del cranio, preparare quattro tamponi di tessuto tagliando un tovagliolo di carta in un quadrato di tre centimetri. Quindi piega i quadrati di carta lungo la loro diagonale per produrre una struttura simile a un tubo e attorciglia le estremità del tubo in una punta sottile. Dopo aver anestetizzato il pesce con 0,03% TMS, eseguire la perfusione della siringa con 0,01% TMS per mantenere la sedazione durante tutta la procedura.
Avvolgere il pesce in un fazzoletto di carta umido partendo dalla punta della coda fino a circa un millimetro caudale rispetto alla branchia. Quindi avvolgere un tubo di plastica morbida con una fessura longitudinale attorno al fazzoletto di carta che copre il pesce dall'estremità della coda fino a circa due millimetri caudali fino alla branchia. Avvolgi il tovagliolo di carta attorno al tubo.
Quindi avvolgere un tubo di plastica morbida tagliato dal bulbo di una pipetta di trasferimento in plastica attorno al tovagliolo di carta. Caricare il pesce avvolto nel cannone. Successivamente, utilizzando un bisturi, rimuovere la pelle che copre i siti di attacco, due aree triangolari del cranio rostrolaterali al cervelletto e sopra le branchie.
Quindi utilizzare tamponi di tessuto per asciugare i siti di attacco e pulire la pelle rimanente. Utilizzando un puntale per pipette da 10 microlitri, applicare una goccia di colla per tessuti al centro di ciascun sito di attacco. Posizionare il corpo del pesce in posizione verticale e posizionare la barra della testa leggermente al di sopra e caudale rispetto ai siti di attacco.
Successivamente, preparare il cemento dentale mescolando un cucchiaino di polimero con quattro gocce di monomero rapido e una goccia di catalizzatore cinque. Mescolare il composto in modo uniforme per 15 secondi. Subito dopo la miscelazione, utilizzare una micropipetta e un puntale da 10 microlitri per applicare il cemento sui siti di attacco e sulla regione tra i siti.
Quindi, utilizzando un micromanipolatore, premere delicatamente la barra di testa sul cemento. Coprire la barra di testa con il cemento rimanente e attendere 12 minuti per consentire l'indurimento del cemento. Successivamente, per migliorare l'accesso ottico al prosencefalo per l'imaging del calcio, utilizzare un bisturi per rimuovere la pelle sopra il telencefalo.
Dopo l'indurimento, rimuovere l'argilla dalla barra di testa. Successivamente, preparare un modulo di caricamento del pesce per il micromanipolatore. Quindi trasferire l'intera capsula dal cannone al regolatore di beccheggio nel modulo di caricamento del pesce.
Utilizzando il micromanipolatore, posizionare il pesce con la barra della testa posizionata sopra i montanti metallici del tavolino di testa. Aumentare leggermente l'angolo di beccheggio del pesce. Applicare colla polimerizzabile a raggi ultravioletti per fissare la barra di testa ai montanti metallici.
Quindi estrarre il pesce dalla capsula e bloccare lo stadio di testa sulla piastra di base all'interno della vasca semiesagonale. Dopo l'intervento chirurgico, immergere l'animale nell'acqua dell'acquario per riprendersi dall'anestesia.
