Per iniziare, preparare da 10 a 20 microgrammi di RNA totale di alta qualità per l'isolamento di RNA poli(A)arricchito. Trasferire un'aliquota di RNA in una provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri priva di nucleasi. Incubare il tubo in un blocco termico a 70 gradi Celsius per cinque minuti, quindi posizionarlo sul ghiaccio per due minuti.
Dopo aver risospeso le microsfere di oligo(dT), trasferire il volume richiesto di sospensione di microsfere in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri e posizionarla sul magnete per tre minuti fino a quando le perle magnetiche non formano una pallina. Rimuovere il surnatante e aggiungere un volume uguale di tampone di lisi. Risospendere le perline.
Riposizionare il tubo sul magnete per tre minuti e rimuovere il surnatante. Per il primo ciclo di purificazione, aggiungere il tampone di lisi alla provetta del campione di RNA e mescolare accuratamente. Quindi trasferire la miscela nelle microsfere di oligo(dT) e risospendere completamente il pipettaggio almeno 10 volte.
Lasciare incubare i campioni con rotazione continua a temperatura ambiente. Dopo 15 minuti, posizionare il campione su un magnete per cinque minuti o fino a quando il surnatante non è limpido. Scartare il surnatante.
Aggiungere 600 microlitri di tampone di lavaggio uno alle perle e mescolare con cura per risospendere. Quindi, aggiungi 300 microlitri di tampone di lavaggio due alle perle e mescola con cura per risospendere. Posizionare il tubo sul magnete per cinque minuti o fino a quando il surnatante non è limpido.
Scartare il surnatante. Successivamente, aggiungere 30 microlitri di HCL tris freddo da 10 millimolari alla provetta del campione e incubare a 70 gradi Celsius. Dopo cinque minuti, trasferisci rapidamente il tubo sul magnete.
E quando la sospensione è limpida, trasferire il surnatante contenente l'RNA poli(A)arricchito eluito in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Per il secondo ciclo di purificazione, aggiungere 120 microlitri di tampone di lisi al campione di RNA eluito e mescolare accuratamente. Lavare le perle utilizzate nel primo ciclo di purificazione con un volume uguale di tampone di lisi.
Pipettare 10 volte per risospendere le perle e poi posizionare la provetta sul magnete per cinque minuti prima di scartare il surnatante. Trasferire la miscela tampone di lisi dell'RNA nelle microsfere lavate e miscelare accuratamente mediante pipettaggio. Dopo aver lavato le perle come dimostrato in precedenza, aggiungere 25 microlitri di HCL trimolare freddo da 10 millimolari alla provetta del campione e incubare a 70 gradi Celsius.
Dopo cinque minuti, trasferire rapidamente la provetta al magnete e, quando la sospensione è limpida, trasferire il surnatante contenente RNA poli(a)arricchito eluito in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Successivamente, per la conversione del bisolfito, trasferire 19 microlitri di campione di RNA poli(A) arricchito purificato in una provetta da 0,2 millilitri a otto strisce e aggiungere un microlitro di controllo dello spiking al rapporto predeterminato di uno a 10.000 quantità. Dopo aver aggiunto 130 microlitri di reagente di conversione alle provette e aver mescolato accuratamente, posizionare la provetta nella macchina PCR e avviare il programma PCR.
Dopo la PCR, posizionare la colonna sulla provetta di raccolta e aggiungere 250 microlitri di tampone legante l'RNA alla colonna. Quindi trasferire 150 microlitri di campione trattato con bisolfito nella colonna e pipettare accuratamente. Aggiungere 400 microlitri di etanolo dal 95 al 100% alla colonna, chiudere rapidamente il tappo e capovolgere più volte.
Dopo ripetute centrifugazioni, lavaggi e neutralizzazione con tampone di desolfonazione, trasferire la colonna in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere da 20 a 30 microlitri di acqua priva di nucleasi alla colonna e lasciarla riposare per un minuto. Centrifugare a 10.000 g per 30 secondi a 25 gradi Celsius e trasferire 2,2 microlitri di surnatante in otto provette a striscia per valutare la quantità e la qualità dell'RNA.
L'efficienza dell'arricchimento di poli(A)RNA è stata valutata mediante test di elettroforesi capillare dell'RNA totale, con conseguente diminuzione della contaminazione dell'RNA ribosomiale dopo doppia purificazione in linee cellulari di cancro del pancreas. La quantità di RNA prima e dopo il trattamento con bisolfito è stata valutata mediante elettroforesi capillare. Dopo il trattamento con bisolfito, la distribuzione dimensionale dell'RNA ha mostrato un picco da 200 a 500 nucleotidi a causa della frammentazione causata dalla reazione del bisolfito.
L'elettroforesi capillare dell'amplicone ha mostrato una preparazione di successo della libreria con un primer residuo minimo e nessun picco di sovraamplificazione. Dopo che le letture di sequenziamento sono state allineate alla sequenza di riferimento, la media di 2.440 letture totali è stata mappata sulla sequenza di spiking e il tasso di conversione da C a T totale analizzato ha raggiunto una media del 99,81%
