Iniziare centrifugando la sospensione di cellule neuronali pure murine a 300 G per otto minuti. Aspirare delicatamente il surnatante e risospendere il pellet in 80 microlitri di HBSS con soluzione 0,5 BSA. Dopo aver aggiunto l'anticorpo specifico, incubare le provette a quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Lavare l'anticorpo in eccesso con una soluzione di HBSS-BSA e centrifugare. Aggiungere 20 microlitri di microsfere di antibiotina al pellet, risosspese in HBSS-BSA. Incubare la provetta a quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Quindi, aggiungere 0,5 millilitri di HBSS con soluzione BSA allo 0,5% per ogni 10 alle sette cellule. Risciacquare la colonna con 0,5 millilitri di HBSS con soluzione BSA allo 0,5%. Una volta che il gocciolamento si ferma, posizionare un tubo da 15 millilitri sotto la colonna e far passare 0,5 millilitri di sospensione cellulare attraverso di essa.
Raccogliere l'eluato contenente cellule neuronali non specifiche, quindi pulire la colonna con tre lavaggi di 0,5 millilitri di HBSS con 0,5% di BSA. Ora rimuovi la colonna dal magnete e mettila in un nuovo tubo da 15 millilitri. Aggiungere un millilitro di HBSS con 0,5%BSA e utilizzare lo stantuffo per eliminare le cellule bersaglio.
Dopo la centrifugazione e l'aspirazione del surnatante, risospendere il pellet in 0,5 millilitri di mezzo di placcatura. Contare le cellule in una camera di conteggio Neubauer al microscopio a campo chiaro. Placcare le cellule bersaglio come controllo positivo e le cellule non specifiche come controllo negativo nella piastra a 24 pozzetti preparata.
Incubare a 37 gradi Celsius per 12 ore. I neuroni LepR-positivi hanno iniziato a formare neuriti dopo 48 ore. A DIV4, le estensioni assonali hanno mostrato progressi, mentre i processi dendritici hanno iniziato a comparire.
A DIV6, i neuroni erano sufficientemente sviluppati. Gli studi di immunofluorescenza hanno mostrato che non sono state osservate cellule gliali o altre cellule non neuronali. La natura neuronale delle cellule è stata confermata dalla colorazione della proteina 2 associata ai microtubuli.
A DIV10, il 30% delle cellule LepR-positive esprimeva POMC. La connettività e la funzionalità sinaptica sono state osservate in colture generali contenenti popolazioni neuronali ipotalmiche eterogenee.
