Mentre si lavora sotto una cappa a flusso laminare di classe due, iniziare lavando in sequenza i tessuti adiposi perivascolari o PVAT raccolti dai topi due volte. In primo luogo, utilizzando PBS contenente il 10% di penicillina-streptomicina e, successivamente, utilizzando PBS integrato con l'1% di penicillina-streptomicina. Trasferire i tessuti sciacquati in una capsula di Petri sterile da 60 millimetri e aggiungervi 200 microlitri di soluzione digestiva.
Usando delle forbici sterili, tritare i fazzoletti in pezzi della dimensione di un millimetro cubo. Con l'aiuto di forbici sterili, tagliare un puntale di pipetta di plastica per allargarne l'estremità. Quindi trasferire la miscela di tissue tritato in una provetta da centrifuga da 15 millilitri utilizzando il puntale della pipetta a estremità larga.
Aggiungere sei millilitri di soluzione digestiva ai tessuti per avviare la digestione. Dopo aver legato la provetta orizzontalmente su una rastrelliera, incubarla a 37 gradi Celsius in un agitatore orbitale per 30-45 minuti. Ogni 5-10 minuti, rimuovere il tubo dall'agitatore nell'incubatrice e agitarlo manualmente su e giù energicamente.
Passare la miscela di tessuti digeriti attraverso un colino cellulare da 70 micron in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Sciacquare il filtro con un volume uguale di terreno di coltura per massimizzare la resa cellulare e spegnere la digestione. Trasferire il filtrato in una nuova provetta da centrifuga da 15 millilitri.
Centrifugare la provetta per isolare la frazione vascolare stromale o SVF. Capovolgere il tubo per scartare il surnatante e risospendere il pellet in cinque millilitri di PBS. Centrifugare nuovamente la provetta a 1.800 g per cinque minuti prima di scartare il surnatante.
Risospendere il pellet in un volume appropriato di terreno di coltura. Seminare le cellule in una piastra da 12 pozzetti rivestita di collagene e incubare per una notte a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umida con il 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, rimuovere i detriti cellulari e i globuli rossi aspirando il terreno di coltura e lavando le cellule con PBS integrato con antibiotici preriscaldato a 37 gradi Celsius.
Infine, aggiungere un millilitro di terreno di coltura fresco a ciascun pozzetto e continuare a coltivare le cellule fino a raggiungere lo stadio di confluenza desiderato.
