Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82130012 e 81830010) e dai progetti Nurture per la ricerca di base dello Shanghai Chest Hospital (Grant Number: 2022YNJCQ03).

I protocolli sugli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali presso l'Ospedale Toracico di Shanghai affiliato alla Scuola di Medicina dell'Università Jiao Tong di Shanghai (numero di approvazione: KS23010) ed erano conformi alle normative etiche pertinenti. I topi C57BL/6 maschi e femmine di età compresa tra 4 e 8 settimane sono da preferire per questo esperimento.
1. Preparazione di strumenti chirurgici, tamponi e terreni di coltura
<ol><li>Sterilizzare in autoclave gli strumenti chirurgici (ad es. forbici chirurgiche e pinze standard) a 121 °C per 30 min. Disinfettare gli strumenti microchirurgici con alcol al 75%.</li>
	<li>Preparare soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) integrata con penicillina-streptomicina all'1% v/v e altri 10 ml di PBS integrata con penicillina-streptomicina al 10% v/v. NOTA: Nelle sezioni seguenti, se non espressamente menzionato, il PBS si riferisce al PBS sterile regolare.</li>
	<li>Preparare il tampone Krebs Ringer HEPES BSA: 1% albumina sierica bovina (BSA), 20 mM di HEPES disciolti nella soluzione Krebs Ringer.</li>
	<li>Preparare una soluzione fresca per la digestione: collagenasi di tipo 1 (1 mg/ml) e dispasi II (4 mg/ml) disciolte nel tampone Krebs Ringer HEPES BSA. Sterilizzare la soluzione utilizzando un filtro da 0,2 μm.</li>
	<li>Preparare una piastra a 12 pozzetti rivestita di collagene.<ol><li>Diluire la soluzione di collagene (1 mg/mL) con acqua deionizzata sterile alla concentrazione di 40 μg/mL. Aggiungere 1 mL della soluzione di collagene diluita sulla superficie di ciascun pozzetto per ottenere una concentrazione di 6-10 μg/cm2. Incubare il rivestimento per 1 ora a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione rimanente e sciacquare ogni pozzetto 2 volte con 1 mL di PBS. Utilizzare immediatamente la piastra o asciugarla all'aria in una cappa a flusso laminare di classe II e conservare la piastra rivestita a 2-8 °C. Durante la conservazione, sigillare le piastre rivestite con parafilm.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare il terreno di coltura: Dulbecco's-Modified Eagles Medium (DMEM) ad alto contenuto di glucosio, 10% di siero fetale bovino (FBS), 1% v/v di penicillina-streptomicina. Conservare a 4 °C per un massimo di 2 settimane.</li>
	<li>Preparare il terreno di induzione lipogenico: DMEM ad alto contenuto di glucosio, 10% FBS, 1% v/v penicillina-streptomicina, 1 nM triiodotironina, 1 μM rosiglitazone, 1 μM di insulina, 0,5 mM di 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) e 1 μM di desametasone. Conservare a 4 °C per un massimo di 2 settimane.</li>
	<li>Preparare il terreno di mantenimento: DMEM ad alto contenuto di glucosio, 10% FBS, 1% v/v penicillina-streptomicina, 1 nM triiodotironina, 1 μM di rosiglitazone e 1 μM di insulina. Conservare a 4 °C per un massimo di 2 settimane.</li>
</ol>2. Dissezione e isolamento del tessuto adiposo perivascolare (PVAT)
<ol><li>Sopprimere il topo mediante lussazione cervicale in anestesia isoflurana al 2% o con sovradosaggio di anidride carbonica. Spruzzare con alcool al 75% per la disinfezione della pelle.</li>
	<li>Posizionare il mouse in posizione supina (rivolto verso l'alto).</li>
	<li>Sollevare la pelle, praticare una piccola incisione e separare bruscamente la pelle e i muscoli addominali con forbici chirurgiche lungo la linea mediana ventrale dal bacino al collo. Esporre il cuore e i polmoni tagliando il diaframma e le costole lungo entrambi i lati della linea mediana.</li>
	<li>Rimuovere con cautela il fegato, la milza, l'intestino e i reni. Evitare di tagliare la parete intestinale.</li>
	<li>Rimuovere i polmoni e l'esofago.</li>
	<li>Sollevare delicatamente il cuore con una pinza in una mano e separare l'aorta dalla colonna vertebrale con le forbici chirurgiche nell'altra mano. Quindi, posizionare il cuore e l'aorta in una capsula di Petri da 60 mm con PBS contenente l'1% v/v di penicillina-streptomicina.</li>
	<li>Rimuovere le pinze microchirurgiche e le forbici microchirurgiche dall'alcol e risciacquare con 25 ml di PBS per rimuovere l'alcol in eccesso. Sotto uno stereomicroscopio, rimuovere il timo e altri tessuti dal cuore e dall'aorta, quindi rimuovere il cuore, lasciando l'aorta con i PVAT.</li>
	<li>Trasferire l'aorta con i PVAT in una capsula di Petri pulita da 60 mm con PBS contenente l'1% v/v di penicillina-streptomicina.</li>
	<li>Utilizzare pinze microchirurgiche per rimuovere i PVAT, con un paio di pinze che fissano l'aorta e l'altra che stacca il tessuto adiposo. Rimuovere il più possibile il tessuto vascolare, riducendo al minimo i danni al tessuto adiposo perivascolare.</li>
	<li>Raccogliere il PVAT che circonda l'aorta toracica nella provetta da microcentrifuga da 2 mL contenente DMEM ad alto contenuto di glucosio integrato con penicillina-streptomicina all'1% v/v posta su ghiaccio.</li>
</ol>3. Isolamento della frazione vascolare stromale (SVF)
<ol><li>Sciacquare i tessuti raccolti in sequenza con PBS contenente il 10% v/v di penicillina-streptomicina e PBS contenente l'1% v/v di penicillina-streptomicina. NOTA: Da questa fase in poi, tutti gli esperimenti devono essere eseguiti in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare di classe II.</li>
	<li>Trasferire i tessuti in una capsula di Petri sterile da 60 mm, aggiungere 200 μL di soluzione digestiva e tritarli inpezzi da 1 mm 3 utilizzando forbici sterili.</li>
	<li>Trasferire la miscela in una provetta da centrifuga da 15 mL utilizzando un puntale di pipetta di plastica, l'estremità allargata da un taglio sterile a forbice, e aggiungere 6 mL di soluzione di digestione per avviare la reazione di digestione. NOTA: Una reazione di digestione (3 mL di soluzione di digestione) è sufficiente per i depositi PVAT di sei topi.</li>
	<li>Incubare i tessuti a 37 °C in un incubatore con agitatore orbitale (frequenza 150 giri/min per una miscelazione efficace) per 30-45 minuti. Legare le provette su una griglia per farle scuotere orizzontalmente. Agitare energicamente su e giù a mano per 10 secondi ogni 5-10 minuti. NOTA: La digestione può essere interrotta quando si osserva un fluido digestivo omogeneo e giallastro senza frammenti di tessuto rimasti.</li>
	<li>Filtrare i tessuti digeriti attraverso un colino cellulare da 70 μm in una provetta da centrifuga da 50 mL. Sciacquare il colino cellulare con un volume uguale di terreno di coltura per massimizzare la resa cellulare e fermare la digestione.</li>
	<li>Trasferire il filtrato in una nuova provetta da centrifuga da 15 mL e centrifugare a 1.800 × g per 10 min. Capovolgere la provetta per scartare il surnatante e risospendere i pellet in 5 mL di PBS. Centrifugare a 1.800 × g per 5 min.</li>
	<li>Scartare il surnatante capovolgendo la provetta e risospendere i pellet in un volume appropriato di terreno di coltura. NOTA: I pellet cellulari raccolti da ogni sei topi vengono risospesi in 1 mL di terreno di coltura e seminati in un pozzetto di una piastra da 12 pozzetti.</li>
	<li>Seminare le cellule in una piastra a 12 pozzetti rivestita di collagene e incubare a 37 °C in un'atmosfera umida con il 5% di CO2 per una notte.</li>
	<li>Il giorno successivo, aspirare il terreno di coltura, lavare le cellule con PBS preriscaldato (37 °C) contenente l'1% v/v di penicillina-streptomicina per rimuovere i detriti cellulari e i globuli rossi e aggiungere nuovamente 1 mL di terreno di coltura fresco per ogni pozzetto.</li>
</ol>4. Induzione adipogenica di preadipociti derivati da SVF dal tessuto adiposo periaortico
<ol><li>Cambiare il terreno di coltura a giorni alterni fino a quando le cellule raggiungono ~60-70% di confluenza. NOTA: Di solito ci vogliono 3-4 giorni prima che le cellule raggiungano il 60-70% di confluenza.</li>
	<li>Quando le cellule raggiungono il 60-70% di confluenza, aspirare il terreno di coltura e sostituirlo con terreno di induzione adipogenico bruno. Considerare il giorno di induzione della differenziazione adipogenica come giorno 0 di differenziazione.</li>
	<li>Dopo 72 ore (giorno 3 di differenziazione), rinfrescare il mezzo con il mezzo di mantenimento. Cambiare il mezzo di mantenimento ogni 2 giorni fino a quando le cellule non vengono utilizzate per gli esperimenti.</li>
	<li>Analizzare le cellule adipogeniche in modo appropriato, come la colorazione Oil Red O14 e il western blotting15.</li>
</ol>

Coltura di preadipociti isolati da tessuto adiposo perivascolare murino

<ol>
	<li>Akoumianakis, I., Antoniades, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interplay+between+adipose+tissue+and+the+cardiovascular+system:+is+fat+always+bad.">The interplay between adipose tissue and the cardiovascular system: is fat always bad.</a> Cardiovascular Research. 113 (9), 999-1008 (2017).</li><li>Huang, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thoracic+perivascular+adipose+tissue+inhibits+VSMC+apoptosis+and+aortic+aneurysm+formation+in+mice+via+the+secretome+of+browning+adipocytes.">Thoracic perivascular adipose tissue inhibits VSMC apoptosis and aortic aneurysm formation in mice via the secretome of browning adipocytes.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 44 (2), 345-355 (2023).</li><li>Xia, N., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+perivascular+adipose+tissue+in+obesity-induced+vascular+dysfunction.">The role of perivascular adipose tissue in obesity-induced vascular dysfunction.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3425-3442 (2017).</li><li>Brown, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+in+vascular+function+and+disease:+a+review+of+current+research+and+animal+models.">Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).</li><li>Ferrero, R., Rainer, P., Deplancke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+consensus+view+of+mammalian+adipocyte+stem+and+progenitor+cell+heterogeneity.">Toward a consensus view of mammalian adipocyte stem and progenitor cell heterogeneity.</a> Trends in Cell Biology. 30 (12), 937-950 (2020).</li><li>Angueira, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+lineage+of+thermogenic+perivascular+adipose+tissue.">Defining the lineage of thermogenic perivascular adipose tissue.</a> Nature Metabolism. 3 (4), 469-484 (2021).</li><li>Boucher, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab27a+regulates+human+perivascular+adipose+progenitor+cell+differentiation.">Rab27a regulates human perivascular adipose progenitor cell differentiation.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).</li><li>Saxton, S. N., Withers, S. B., Heagerty, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+sympathetic+nerves+and+inflammation+in+perivascular+adipose+tissue.">Emerging roles of sympathetic nerves and inflammation in perivascular adipose tissue.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 245-259 (2019).</li><li>Ferroni, L., De Francesco, F., Pinton, P., Gardin, C., Zavan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+isolate+adipose+tissue-derived+stem+cells.">Methods to isolate adipose tissue-derived stem cells.</a> Methods in Cell Biology. 171, 215-228 (2022).</li><li>Senesi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+and+enzymatic+procedures+to+isolate+the+stromal+vascular+fraction+from+adipose+tissue:+preliminary+results.">Mechanical and enzymatic procedures to isolate the stromal vascular fraction from adipose tissue: preliminary results.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 88 (2019).</li><li>Andia, I., Maffulli, N., Burgos-Alonso, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+vascular+fraction+technologies+and+clinical+applications.">Stromal vascular fraction technologies and clinical applications.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (12), 1289-1305 (2019).</li><li>Suh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+cellular+and+cell-derived+regenerative+therapies+in+dermatology+and+aesthetic+rejuvenation.">Adipose-derived cellular and cell-derived regenerative therapies in dermatology and aesthetic rejuvenation.</a> Ageing Research Reviews. 54, 100933 (2019).</li><li>Bellei, B., Migliano, E., Picardo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+adipose+tissue-derivatives+in+modern+dermatology.">Therapeutic potential of adipose tissue-derivatives in modern dermatology.</a> Experimental Dermatology. 31 (12), 1837-1852 (2022).</li><li>Kraus, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+adipocyte+differentiation+in+cell+culture.">Quantitative assessment of adipocyte differentiation in cell culture.</a> Adipocyte. 5 (4), 351-358 (2016).</li><li>Figueroa, A. M., Stolzenbach, F., Tapia, P., Cort&#233;s, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+imaging+of+brown+adipocytes+from+the+stromal+vascular+fraction+of+interscapular+adipose+tissue+from+newborn+mice.">Differentiation and imaging of brown adipocytes from the stromal vascular fraction of interscapular adipose tissue from newborn mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (192), (2023).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methotrexate+improves+perivascular+adipose+tissue/endothelial+dysfunction+via+activation+of+AMPK/eNOS+pathway.">Methotrexate improves perivascular adipose tissue/endothelial dysfunction via activation of AMPK/eNOS pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 15 (4), 2353-2359 (2017).</li><li>Li, X., Ballantyne, L. L., Yu, Y., Funk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue-derived+extracellular+vesicle+miR-221-3p+mediates+vascular+remodeling.">Perivascular adipose tissue-derived extracellular vesicle miR-221-3p mediates vascular remodeling.</a> FASEB Journal. 33 (11), 12704-12722 (2019).</li><li>Ruan, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue-derived+complement+3+is+required+for+adventitial+fibroblast+functions+and+adventitial+remodeling+in+deoxycorticosterone+acetate-salt+hypertensive+rats.">Perivascular adipose tissue-derived complement 3 is required for adventitial fibroblast functions and adventitial remodeling in deoxycorticosterone acetate-salt hypertensive rats.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (12), 2568-2574 (2010).</li><li>Adachi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beiging+of+perivascular+adipose+tissue+regulates+its+inflammation+and+vascular+remodeling.">Beiging of perivascular adipose tissue regulates its inflammation and vascular remodeling.</a> Nature Communications. 13 (1), 5117 (2022).</li><li>Ye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+functional+characteristics+of+the+thoracic+aorta+perivascular+adipocyte.">Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).</li><li>Stanek, A., Bro&#380;yna-Tkaczyk, K., My&#347;li&#324;ski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+obesity-induced+perivascular+adipose+tissue+(PVAT)+dysfunction+in+vascular+homeostasis.">The role of obesity-induced perivascular adipose tissue (PVAT) dysfunction in vascular homeostasis.</a> Nutrients. 13 (11), 3843 (2021).</li><li>Queiroz, M., Sena, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+in+age-related+vascular+disease.">Perivascular adipose tissue in age-related vascular disease.</a> Ageing Research Reviews. 59, 101040 (2020).</li><li>Fitzgibbons, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarity+of+mouse+perivascular+and+brown+adipose+tissues+and+their+resistance+to+diet-induced+inflammation.">Similarity of mouse perivascular and brown adipose tissues and their resistance to diet-induced inflammation.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), H1425-H1437 (2011).</li><li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+perivascular+adipose+tissue+on+peroxisome+proliferator-activated+receptor-&#947;+deletion+in+smooth+muscle+cells+impairs+intravascular+thermoregulation+and+enhances+atherosclerosis.">Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-&#947; deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis.</a> Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).</li><li>Piacentini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+expression+profiling+unveils+autoimmune+response+signatures+in+the+perivascular+adipose+tissue+of+abdominal+aortic+aneurysm.">Genome-wide expression profiling unveils autoimmune response signatures in the perivascular adipose tissue of abdominal aortic aneurysm.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (2), 237-249 (2019).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+reveals+perivascular+adipose+tissue+plasticity+in+response+to+angiotensin+II.">RNA sequencing reveals perivascular adipose tissue plasticity in response to angiotensin II.</a> Pharmacological Research. 178, 106183 (2022).</li><li>Shi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascending+aortic+perivascular+adipose+tissue+inflammation+associates+with+aortic+valve+disease.">Ascending aortic perivascular adipose tissue inflammation associates with aortic valve disease.</a> Journal of Cardiology. 80 (3), 240-248 (2022).</li><li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cells+differentiate+into+brown+adipocytes+and+contribute+to+periaortic+arch+adipose+tissue+formation.">Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (8), 1629-1644 (2019).</li><li>Gil-Ortega, M., Somoza, B., Huang, Y., Gollasch, M., Fern&#225;ndez-Alfonso, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+differences+in+perivascular+adipose+tissue+impacting+vascular+homeostasis.">Regional differences in perivascular adipose tissue impacting vascular homeostasis.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 26 (7), 367-375 (2015).</li><li>Bar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+magnetic+resonance+imaging-based+detection+of+heterogeneous+endothelial+response+in+thoracic+and+abdominal+aorta+to+short-term+high-fat+diet+ascribed+to+differences+in+perivascular+adipose+tissue+in+mice.">In vivo magnetic resonance imaging-based detection of heterogeneous endothelial response in thoracic and abdominal aorta to short-term high-fat diet ascribed to differences in perivascular adipose tissue in mice.</a> Journal of the American Heart Association. 9 (21), e016929 (2020).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse, finanziari o di altro tipo, da dichiarare.

Proponiamo un approccio pratico e fattibile per l'isolamento e l'induzione adipogenica di preadipociti derivati da SVF dal tessuto adiposo periaortico di topo. I vantaggi di questo protocollo sono che è semplice ed economico. Un numero adeguato di topi è fondamentale per il successo dell'isolamento, poiché un tessuto insufficiente può causare una bassa densità di SVF e uno scarso stato di crescita, influenzando in ultima analisi l'efficienza lipogenica. Inoltre, l'età del topo è un fattore importante da considerar...

Si ritiene che il tessuto adiposo perivascolare (PVAT), una struttura perivascolare composta da una miscela di adipociti maturi e una frazione vascolare stromale (SVF), interagisca con la parete del vaso adiacente tramite il suo secretomaparacrino 1. Come regolatore critico dell'omeostasi vascolare, la disfunzione PVAT è implicata nella patogenesi delle malattie cardiovascolari 2,3,4. La SVF del tessuto adipocitario è costituita da diverse popolazioni cellulari previste, tra cui cellule endoteliali, cellule immunitarie, cellule del mesotelio, cellule neuronali e cellule staminali e progenitrici adipose (ASPC)5,6. E' noto che le ASPC che risiedono nella SVF del tessuto adiposo possono dare origine ad adipociti maturi5. Si ritiene che la SVF sia una fonte critica di adipociti maturi nel PVAT. Diversi studi hanno dimostrato che PVAT-SVF può differenziarsi in adipociti maturi in specifiche condizionidi induzione 6,7,8.
Attualmente, esistono due sistemi di isolamento per isolare SVF dal tessuto adiposo, uno è la digestione enzimatica e l'altro è non enzimatico9. I metodi enzimatici in genere determinano una maggiore resa di cellule progenitrici nucleate10. Ad oggi, i benefici della SVF nel promuovere la rigenerazione vascolare e la neovascolarizzazione nelle malattie della guarigione delle ferite, urogenitali e cardiovascolari sono stati ampiamente dimostrati11, in particolare in dermatologia e chirurgia plastica12,13. Tuttavia, le prospettive di applicazione clinica delle SVF derivate da PVAT non sono state ben esplorate, il che può essere attribuito alla mancanza di un metodo standardizzato per l'isolamento delle SVF da PVAT. L'obiettivo di questo protocollo è quello di stabilire un approccio standardizzato per l'isolamento, la coltura e l'induzione adipogenica di preadipociti derivati da SVF da PVAT di topo che circondano l'aorta toracica, consentendo ulteriori indagini sulla funzione di PVAT. Questo protocollo ottimizza le tecniche di processamento tissutale e di differenziamento cellulare per la coltura di adipociti periaortici ottenuti da topi giovani.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m syringe filters</td>
			<td>PALL</td>
			<td>4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate&#160;</td>
			<td>Labselect</td>
			<td>11210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>310109003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-triiodo-L-thyronine (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-2877</td>
			<td>1 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Labselect</td>
			<td>CT-002-50A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-adiponectin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22554</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-COX IV</td>
			<td>CST</td>
			<td>4850</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FABP4</td>
			<td>CST</td>
			<td>2120</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PGC1&#945;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab191838</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PPAR&#947;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-14889</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-UCP1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab10983</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#945;-Actinin</td>
			<td>CST</td>
			<td>6487</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST023-200g</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes</td>
			<td>Shanghai Model Organisms Center, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 70 &#181;m, nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1756</td>
			<td>1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4693-1G</td>
			<td>4 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034-25G</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with orbital shaker</td>
			<td>Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd.</td>
			<td>LYZ-103B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (cattle)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11070-73-8</td>
			<td>1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD</td>
			<td>R510-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs-Ringer&#39;s Solution</td>
			<td>Pricella&#160;</td>
			<td>PB180347</td>
			<td>protect from light&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical forceps</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FS233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical scissor</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FS217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O&#160;</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>A600395-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>B548117-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>115-035-146</td>
			<td>1:5,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td>1:5,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td>1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FS225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissor</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FS001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mouse periaortic adipose tissue

Il tessuto adiposo perivascolare (PVAT) è un deposito di tessuto adiposo che circonda i vasi sanguigni e presenta i fenotipi di adipociti bianchi, beige e marroni. Recenti scoperte hanno messo in luce il ruolo centrale del PVAT nella regolazione dell'omeostasi vascolare e nella partecipazione alla patogenesi delle malattie cardiovascolari. Una comprensione completa delle proprietà e della regolazione del PVAT è di grande importanza per lo sviluppo di future terapie. Le colture primarie di adipociti periaortici sono preziose per studiare la funzione PVAT e il crosstalk tra adipociti periaortici e cellule vascolari. Questo articolo presenta un protocollo economico e fattibile per l'isolamento, la coltura e l'induzione adipogenica di preadipociti derivati dalla frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo periaortico di topo, che può essere utile per modellare l'adipogenesi o la lipogenesi in vitro. Il protocollo delinea l'elaborazione dei tessuti e la differenziazione cellulare per la coltura di adipociti periaortici da topi giovani. Questo protocollo fornirà la pietra angolare tecnologica a bordo banco per lo studio della funzione PVAT.

Perivascular adipose tissue (PVAT), a perivascular structure composed of a mixture of mature adipocytes and a stromal vascular fraction (SVF), is believed to interact with the adjacent vessel wall via its secretome paracrineally1. As a critical regulator of vascular homeostasis, PVAT dysfunction is implicated in the pathogenesis of cardiovascular diseases2,3,4. The SVF of adipocyte tissue consists of several expected cell populations, including endothelial cells, immune cells, mesothelium cells, neuronal cells, and adipose stem and progenitor cells (ASPCs)5,6. It is well known that ASPCs residing in the SVF of adipose tissue can give rise to mature adipocytes5. SVF is inferred to be a critical source of mature adipocytes in PVAT. Several studies have shown that PVAT-SVF can differentiate into mature adipocytes under specific induction conditions6,7,8.
Currently, there are two isolation systems for isolating SVF from adipose tissue, one is enzymatic digestion and the other is non-enzymatic9. Enzymatic methods typically result in a higher yield of nucleated progenitor cells10. To date, the benefits of SVF in promoting vascular regeneration and neovascularization in wound healing, urogenital, and cardiovascular diseases have been widely demonstrated11, especially in dermatology and plastic surgery12,13. However, the clinical application prospects of PVAT-derived SVF have not been well explored, which may be attributed to the lack of a standardized method for the isolation of SVF from PVAT. The objective of this protocol is to establish a standardized approach for the isolation, culture, and adipogenic induction of SVF-derived preadipocytes from mouse PVAT surrounding the thoracic aorta, enabling further investigation of PVAT function. This protocol optimizes tissue processing and cell differentiation techniques for culturing periaortic adipocytes obtained from young mice.

Autore in primo piano: Il significato dell'isolamento, della coltura e dell'induzione adipogenica dei preadipociti derivati da SVF dal tessuto adiposo perivascolare di topo 

Isolamento, coltura e induzione adipogenica di preadipociti derivati dalla frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo periaortico di topo

We aim to establish a standardized approach for the isolation culture and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mass PVAT. This protocol enables us to conduct further investigations into PVAT function and into the communication between periaortic adipocytes and vascular cells in vitro. The main challenges we currently face in our experiments include the restricted of availability of PVAT and the requirements for additional human and the material resources when compared to using immortalized preadipocytes.Our protocol allows for the study of perivascular adipose tissue function and it's relationship with vascular cells. We also offers a basis for studying PVAT ring and genes, and heterogeneity, and provides a platform for exploring the important regulator of PVAT differentiation and the adipogenesis in vitro.

Utilizzando questo protocollo sopra descritto, abbiamo isolato accuratamente i PVAT che circondano l'aorta toracica del topo (Figura 1A-D). Dopo aver lavato e tritato i PVAT in piccoli pezzi utilizzando forbici sterili (Figura 1E,F), i frammenti di tessuto sono stati digeriti in una soluzione digestiva contenente collagenasi di tipo 1 (1 mg/mL) e dispasi II (4 mg/mL) e incubati a 37 °C su uno shaker per 30-45 minuti (Fi...

Watch this Scientific Journal Video about The Significance of Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of SVF-Derived Preadipocytes from Mouse Perivascular Adipose Tissue at JoVE.com

Qui, descriviamo l'isolamento, la coltura e l'induzione adipogenica di preadipociti derivati dalla frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo periaortico di topo, consentendo lo studio della funzione del tessuto adiposo perivascolare e della sua relazione con le cellule vascolari.

Perivascular adipose tissue (PVAT) is an adipose tissue depot that surrounds blood vessels and exhibits the phenotypes of white, beige, and brown ...

Il nostro obiettivo è quello di stabilire un approccio standardizzato per la coltura di isolamento e l'induzione adipogenica di preadipociti derivati dalla frazione vascolare stromale da PVAT di massa. Questo protocollo ci permette di condurre ulteriori indagini sulla funzione di PVAT e sulla comunicazione tra adipociti periaortici e cellule vascolari in vitro. Le principali sfide che attualmente affrontiamo nei nostri esperimenti includono la limitata disponibilità di PVAT e i requisiti di risorse umane e materiali aggiuntive rispetto all'utilizzo di preadipociti immortalizzati.Il nostro protocollo permette di studiare la funzione del tessuto adiposo perivascolare e la sua relazione con le cellule vascolari. Offriamo anche una base per lo studio dell'anello e dei geni PVAT e dell'eterogeneità, e forniamo una piattaforma per esplorare l'importante regolatore del differenziamento PVAT e l'adipogenesi in vitro.

isolation-culture-adipogenic-induction-stromal-vascular-fraction

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue

1.2K Views.  Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Il nostro obiettivo è quello di stabilire un approccio standardizzato per la coltura di isolamento e l'induzione adipogenica di preadipociti derivati dalla frazione vascolare stromale da PVAT di massa. Questo protocollo ci permette di condurre ulteriori indagini sulla funzione di PVAT e sulla comunicazione tra adipociti periaortici e cellule vascolari in vitro. Le principali sfide che attualmente affrontiamo nei nostri esperimenti includono la limitata disponibilità di PVAT e i requisiti di...

Video: Autore in primo piano: Il significato dell'isolamento, della coltura e dell'induzione adipogenica dei preadipociti derivati da SVF dal tessuto adiposo perivascolare di topo 

Perivascular adipose tissue (PVAT) is an adipose tissue depot that surrounds blood vessels and exhibits the phenotypes of white, beige, and brown adipocytes. Recent discoveries have shed light on the central role of PVAT in regulating vascular homeostasis and participating in the pathogenesis of cardiovascular diseases. A comprehensive understanding of PVAT properties and regulation is of great importance for the development of future therapies. Primary cultures of periaortic adipocytes are valuable for studying PVAT function and the crosstalk between periaortic adipocytes and vascular cells. This paper presents an economical and feasible protocol for the isolation, culture, and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mouse periaortic adipose tissue, which can be useful for modeling adipogenesis or lipogenesis in vitro. The protocol outlines tissue processing and cell differentiation for culturing periaortic adipocytes from young mice. This protocol will provide the technological cornerstone at the bench side for the investigation of PVAT function.

Here, we describe the isolation, culture, and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mouse periaortic adipose tissue, allowing for the study of perivascular adipose tissue function and its relationship with vascular cells.

Ricerca

Biologia

Dissection and Isolation of Murine Perivascular Adipose Tissue (PVAT)

Begin by spraying the properly euthanized mouse with 75%alcohol to disinfect the skin. Then place the mouse in a supine position. Lift the skin of the animal's abdominal region, and using surgical scissors, make a small incision in it.Then using the scissors, bluntly separate the skin and abdominal muscles from the pelvis to the neck, along the ventral midline. Expose the heart and lungs by cutting the diaphragm and ribs along both sides of the midline. Next, carefully remove the liver, spleen, bowels, and kidney, avoiding damage to the intestinal wall.Following that, remove the lungs and esophagus. Now gently lift the heart using forceps held in one hand and separate the aorta from the spine with surgical scissors held in the other hand. Then place the heart and aorta in a 60 millimeter petri dish, containing antibiotic supplemented PBS.Retrieve the microsurgical forceps and microsurgical scissors from the alcohol, and rinse them in 25 milliliters of PBS to remove excess alcohol. Working under a stereo microscope, remove the thymus and other tissues from the heart and aorta. Then remove the heart, leaving the aorta with the perivascular adipose tissues or PVATs.Transfer the aorta along with the PVATs to a clean 60 millimeter petri dish containing antibiotic supplemented PBS. Using one pair of microsurgical forceps, hold the aorta, and using another pair, pull off the attached adipose tissues to separate the PVATs from the aorta. Remove as much vascular tissue as possible while causing minimal harm to the PVATs.Finally, transfer the collected PVATs into a two milliliter microcentrifuge tube, containing antibiotic supplemented, high glucose, DMEM, placed on ice.

Dissezione e isolamento del tessuto adiposo perivascolare murino (PVAT)

Isolation of Stromal Vascular Fraction (SVF) from Perivascular Adipose Tissue (PVAT)

While working under a class two laminar flow hood, begin by sequentially washing the perivascular adipose tissues or PVATs collected from mice two times. First, using PBS containing 10%penicillin-streptomycin, and, next, using PBS supplemented with 1%penicillin-streptomycin. Transfer the rinsed tissues into a sterile 60-millimeter Petri dish and add 200 microliters of digestion solution to it.Using sterile scissors, mince the tissues into pieces having a dimension of one cubic millimeter. With the help of sterile scissors, cut a plastic pipette tip to broaden its end. Then transfer the minced tissue mix to a 15-milliliter centrifuge tube using the broad-ended pipette tip.Add six milliliters of the digestion solution to the tissues to initiate digestion. After tying the tube horizontally on a rack, incubate it at 37 degrees Celsius in an orbital shaker for 30 to 45 minutes. Every 5 to 10 minutes, remove the tube from the shaker in the incubator and manually shake it up and down vigorously.Pass the digested tissue mix through a 70-micron cell strainer into a 50-milliliter centrifuge tube. Rinse the strainer with an equal volume of culture medium to maximize cell yield and quench digestion. Transfer the filtrate to a new 15-milliliter centrifuge tube.Centrifuge the tube to isolate the stromal vascular fraction or SVF. Invert the tube to discard the supernatant and re-suspend the pellet in five milliliters of PBS. Centrifuge the tube again at 1, 800 G for five minutes before discarding the supernatant.Re-suspend the pellet in an appropriate volume of culture medium. Seed the cells into a collagen-coated 12-well plate and incubate overnight at 37 degrees Celsius in a humid atmosphere with 5%carbon dioxide. On the next day, remove cell debris and red blood cells by aspirating the culture medium and washing the cells with antibiotic-supplemented PBS pre-warmed to 37 degrees Celsius.Finally, add one milliliter of fresh culture medium to each well, and continue culturing the cells until they reach the desired stage of confluency.