Per iniziare, rimuovere i cappucci superiore e inferiore dalla colonna di rotazione del kit di arricchimento proteico commerciale e conservarli per un uso futuro. Posizionare la colonna di centrifuga senza tappo in una provetta da microcentrifuga da due millilitri. Centrifugare l'impianto a 1000 G e a temperatura ambiente per 30-60 secondi per rimuovere ed eliminare la soluzione di conservazione.
Aggiungere 200 microlitri di tampone di lavaggio alle perle di arricchimento nella colonna di centrifuga e mescolare pipettando su e giù più volte. Dopo aver centrifugato la colonna di rotazione come dimostrato in precedenza, scartare il tampone raccolto. Riposizionare il tappo inferiore e aggiungere 200 microlitri d'acqua alla colonna di centrifuga prima di sostituire il tappo superiore.
Miscelare l'impasto a microsfere acquose preparato pipettandolo su e giù prima di trasferirne 40 microlitri sul campione di prodotto farmaceutico anticorpo monoclonale pre-preparato. Incubare la provetta ruotandola a temperatura ambiente per due ore. Quindi, praticare dei fori in una fritta di dimensioni adeguate utilizzando un ago calibro 16 e inserirla nell'estremità della punta di una punta da 200 microlitri.
Trasferire il campione con le microsfere sulla punta preparata e posizionarlo in una provetta da microcentrifuga da due millilitri con un foro nel tappo superiore. Centrifugare la punta nella provetta per rimuovere la soluzione. Lavare le perline aggiungendo 200 microlitri di tampone di lavaggio alla punta.
Rimuovere il tampone di lavaggio centrifugando la punta in una provetta da microcentrifuga da due millilitri. Successivamente, lavare le perline nella punta con 200 microlitri di acqua e centrifugare come mostrato in precedenza per rimuovere l'acqua. A questo punto, aggiungere 10 microlitri di tampone di eluizione alla punta e immergere accuratamente le perle pipettando l'impasto su e giù 10 volte.
Trasferire la punta in una nuova provetta da microcentrifuga da 0,5 millilitri con un foro nel tappo superiore e centrifugare la provetta per raccogliere la proteina elusa. Aggiungere 1,5 microlitri di soluzione di tripsina nell'eluente e lasciarlo digerire per una notte a 28 gradi. Quindi, aggiungere 1,5 microlitri di 25 milligrammi per millilitro di ditiotreitolo al campione e incubarlo a 90 gradi per 20 minuti.
Successivamente, incubare il campione con 1,5 microlitri di iodoacetammide molare 0,25 a temperatura ambiente al buio per 20 minuti. Successivamente, aggiungere 3,5 microlitri di acido tricloroacetico al 10% o TFA e agitare il campione per due minuti. Centrifugare il campione a 14.400 G per 10 minuti a temperatura ambiente per precipitare SDC e SLS.
Raccogliere il surnatante acidificato per la dissalazione. Aggiungere 50 microlitri di tampone B alla punta di desalinizzazione GC. Quindi posizionare la punta in un supporto e centrifugarla a 1000 G per tre minuti a temperatura ambiente.
Aggiungere 50 microlitri di tampone A alla punta e far girare la punta come dimostrato in precedenza. A questo punto, aggiungere il campione acidificato alla punta. Centrifugare la punta nel supporto a 500 g per sei minuti a temperatura ambiente.
Successivamente, lavare la punta aggiungendo 50 microlitri di tampone A e farla girare a 500 g per tre minuti a temperatura ambiente. Eluire il peptide dal puntale di desalinizzazione GC aggiungendo 50 microlitri di tampone B e centrifugando il puntale in una nuova provetta a 500 G per tre minuti a temperatura ambiente. Successivamente, asciugare l'eluente raccolto utilizzando un concentratore sottovuoto.
Risospendere l'eluente essiccato in 30 microlitri di soluzione di acido formico allo 0,1%. Misurare l'assorbanza ultravioletta delle miscele peptidiche a 214 nanometri utilizzando uno spettrofotometro. Infine, trasferire 10 microlitri del campione digerito in una fiala di campione per cromatografia liquida e analizzare un microgrammo del campione utilizzando nano LC-MS/MS.
I profili del cromatogramma ionico totale delle proteine della cellula ospite hanno rivelato che, rispetto alla digestione diretta, la maggior parte dei principali peptidi di anticorpi monoclonali sono stati ridotti o eliminati dopo l'arricchimento proteico dimostrato abbinato a un protocollo di digestione limitato.
