Dal recipiente del bioreattore del serbatoio agitato, interrompere temporaneamente il controllo della temperatura, del pH e dell'ossigeno disciolto sul controller del bioreattore ed erogare completamente tutto il PBS dal recipiente nel flacone di scarto. Saldare al modulo di filtrazione monouso a una porta sulla borsa monouso da 10 litri. Filtrare e trasferire il terreno MSC completo senza siero nella custodia.
Impostare la velocità della pompa a 300 giri/min. Ed erogare un litro di mezzo dal sacchetto di alimentazione nel recipiente. Arrestare la pompa.
E avviare la temperatura pH e disciolto di nuovo in DO, secondo le istruzioni del produttore. Sigillare e scollegare il tubo che collega il feedback al tubo di alimentazione. Saldare il tubo dal flacone di micro vettori dispersi al tubo di alimentazione.
E pompare tutto il contenuto dalla bottiglia nel recipiente. Successivamente, sospendere nuovamente 2,5 volte 10 agli otto HMC in un terreno privo di siero e trasferirli nel flacone vuoto precedentemente contenente la sospensione del micro carrier. Aggiungere il terreno senza siero fino a 500 millilitri in totale all'interno del flacone e mescolare la sospensione cellulare.
Pompare tutto il contenuto del flacone nel recipiente. Sigillare e scollegare il tubo che collega il flacone al tubo di alimentazione, quindi saldare nuovamente il sacchetto di alimentazione. Regolare le impostazioni di agitazione sul controller per avviare l'inoculazione cellulare ai micro carrier.
E istituire un regime automatizzato di integrazione e scambio di mezzi. Saldare i sacchetti di campionamento monouso al tubo di campionamento. E raccogli i campioni nei punti temporali desiderati.
Al momento del prelievo delle cellule sul controller, impostare la velocità di agitazione su zero per consentire ai micro vettori di assestarsi. E distribuire il surnatante nel regime di alimentazione, lasciando circa un litro di sospensione di coltura nel recipiente. Saldare la sacca contenente 50 millilitri di soluzione digestativa appena preparata a 500 millilitri di HBSS per la diluizione.
E pompare tutta la soluzione nel recipiente, attraverso il tubo di alimentazione. Impostare la velocità di agitazione tra 40 e 45 giri/min per sciogliere i micro carrier. Dopo che i micro vettori si sono dissolti entro 40-60 minuti, saldare il sacchetto di conservazione usa e getta da tre litri al tubo di raccolta e pompare completamente la sospensione cellulare.
Attivare il sistema di elaborazione delle cellule durante il prelievo delle cellule. E installare un kit di elaborazione delle celle monouso sullo strumento, secondo le istruzioni del produttore. Saldare le sacche di sospensione cellulare, tampone di lavaggio e terreno di coltura al kit.
Inserire i parametri operativi e avviare il processo di lavaggio e risospensione automatizzato. Raccogliere il campione di cellule dalla camera della centrifuga come indicato dai sistemi di elaborazione delle celle per il calcolo della densità cellulare. Dopo il conteggio, regolare nuovamente la densità cellulare a due volte 10 a sei cellule per millilitro, utilizzando il terreno privo di siero completo.
Per il processo di formulazione cellulare in un bioreattore da 15 litri, utilizzare il tampone di formulazione per risospendere le cellule raccolte. Saldare 250 millilitri di celle risospese al riempimento della cella. Assemblare il kit di materiali di consumo monouso di riempimento e finitura sul sistema di riempimento delle celle.
E accendere il sistema di pre-raffreddamento, seguendo le istruzioni del produttore prima che le celle siano state ri-sospese. Seguire le istruzioni sul sistema e impostarlo per riempire 30 millilitri per sacchetto con un totale di 20 sacchetti per set. Saldare il nuovo set di 20 sacche di crioconservazione al kit di materiali di consumo monouso di riempimento e finitura e ripetere il riempimento e la finitura fino a quando tutte le cellule non sono aliquote.
Per le hMSC, è stata raggiunta un'espansione cumulativa di 128 volte con vitalità cellulare superiore al 90%L'assunzione di glucosio ha mostrato una correlazione negativa con l'espansione cellulare, mostrando il metabolismo associato alla crescita di cellule sane. Le MSC appena raccolte conservano i marcatori fenotipici classici con un'espressione superiore al 95% per i marcatori positivi e inferiore al 2% per i marcatori negativi. Le cellule crioconservate hanno mostrato una buona adesione, un normale comportamento di espansione e una tipica forma del fuso con crescita a spirale dopo lo scongelamento e la riplaccatura in palloni 2D.
Inoltre, le cellule hanno anche mantenuto la loro capacità di differenziarsi in linee osteogeniche, adipogeniche e condrogeniche. Questa piattaforma può essere adottata anche per coltivare altre cellule dipendenti dall'ancoraggio, come le cellule HEK293T e Vero. Dopo il processo di trasferimento B2B nel bioreattore da 15 litri, le cellule HEK293T hanno raggiunto una concentrazione cellulare di picco di 1,68 volte 10 delle sette cellule per millilitro.
Mentre le cellule Vero hanno raggiunto una concentrazione di 1,08 volte 10 alle sette cellule. Entrambi i tipi di cellule hanno mantenuto un'elevata vitalità.
