Per iniziare, prendi 10 milligrammi di mitocondri di lievito grezzo appena isolati e risospendili in 1,6 millilitri di tampone SM a quattro gradi Celsius mediante pipettaggio. Quindi, trasferire la sospensione mitocondriale in un pallone di Erlenmeyer da 100 millilitri preraffreddato. Aggiungere lentamente, aggiungere 16 millilitri di tampone di rigonfiamento, utilizzando una pipetta di vetro da 20 millilitri mentre si applica una leggera agitazione costante sul ghiaccio.
Incubare i campioni con una leggera agitazione costante per 30 minuti su ghiaccio. Quindi, aggiungere lentamente cinque millilitri di soluzione di saccarosio a 2,5 molari utilizzando una pipetta di vetro da cinque millilitri, consentendo alla membrana interna di restringersi. Incubare i campioni agitando leggermente per 15 minuti su ghiaccio.
Per generare vescicole di membrana sub-mitocondriale, trasferire la sospensione mitocondriale in una cella a rosetta pre-raffreddata e sonicare la sospensione al 10% di ampiezza per 30 secondi raffreddando la cella a rosetta in un bagno di ghiaccio. Far riposare la sospensione per 30 secondi in un bagno di ghiaccio.
