Per iniziare, prendi le vescicole sub-mitocondriali del lievito preparate e centrifuga le vescicole generate e i mitocondri rimasti intatti a 20.000 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. I mitocondri intatti hanno formato il pellet mentre le vescicole rimangono nel surnatante. Successivamente, trasferire il surnatante in provette di ultracentrifugazione fresche.
Caricare un cuscino di 0,3 millilitri di soluzione di saccarosio a 2,5 molari sul fondo della provetta utilizzando una siringa da un millilitro dotata di cannula e centrifugare a 118.000 G per 100 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, le vescicole appariranno come un disco sulla parte superiore del cuscino di saccarosio. Scartare circa il 90% del surnatante.
Per raccogliere le vescicole concentrate, risospenderle nel tampone rimanente, compreso il saccarosio molare 2,5 mediante pipettaggio. Trasferire la sospensione in un omogeneizzatore Dounce ghiacciato e omogeneizzare la sospensione utilizzando un vasaio in politetrafluoroetilene con almeno 10 colpi. Successivamente, preparare un gradiente a gradini di 11 millilitri con ogni strato contenente 2,2 millilitri di soluzione di saccarosio.
Calcola la concentrazione di saccarosio usando questa formula. Aggiungere la massima concentrazione di saccarosio nella provetta di centrifugazione e posizionarla a meno 20 gradi Celsius fino a quando lo strato non è completamente congelato. Misurare la concentrazione di saccarosio dei campioni utilizzando un rifrattometro.
Se non è disponibile un rifrattometro, si supponga che la concentrazione di saccarosio sia di 2 molari. Per regolare la concentrazione di saccarosio a 0,6 molari, aggiungere il cocktail appropriato di MOPS, E-D-T-A, P-M-S-F e inibitore della proteasi a pH 7,4. Caricare con cautela i campioni sul gradiente di saccarosio per evitare il disturbo del gradiente.
Centrifugare le vescicole a 200.000 G e 4 gradi Celsius per 12 ore. Se possibile, impostare un'accelerazione e una decelerazione lente per evitare l'interruzione del gradiente. Quindi raccogliere il gradiente dall'alto verso il basso in frazioni da 700 microlitri, utilizzando una pipetta da un millilitro.
Il risultato è 17 frazioni, che forniscono una risoluzione sufficiente. Successivamente, eseguire due precipitazioni di acido tricloroacetico eseguite in sequenza aggiungendo 200 microlitri di acido tricloroacetico al 72% alle singole frazioni e mescolando fino a ottenere una soluzione omogenea. Incubare le frazioni per 30 minuti su ghiaccio e pellettare le proteine precipitate centrifugando a 20.000 G e quattro gradi Celsius per 20 minuti.
Scartare il surnatante. Aggiungere 500 microlitri di soluzione di acido tricloroacetico al 28%. Mescolare bene e ripetere la fase di centrifugazione.
Infine, analizzare le frazioni mediante SDS-PAGE e immunoblotting. L'importanza di una lieve sonicazione è presentata qui. Il marcatore mitocondriale della membrana esterna Tom40 è stato arricchito nelle prime frazioni a bassa densità ed è stato praticamente assente in quelle successive.
Il marcatore mitocondriale della membrana interna Tim17 era concentrato in frazioni ad alta densità. Al contrario, la proteina del sito di contatto Mic60 ha accumulato infrazioni della concentrazione intermedia di saccarosio, indicando la generazione riuscita e la successiva separazione delle varie vescicole di membrana. Al contrario, con condizioni di sonicazione più difficili, il marcatore mitocondriale della membrana esterna Tom40 potrebbe essere rilevato in frazioni inferiori del gradiente.
Inoltre, c'è stata una quantità significativa di infrazioni Tim17 di densità intermedia.
