Per estrarre i metaboliti intracellulari dall'olobionte liofilizzato, aggiungere 400 microlitri di metanolo freddo al 100% con standard interni all'olobionte liofilizzato. Quindi aggiungere 10 milligrammi di perle di vetro lavate con acido e posizionare il tubo in un mulino per perline preraffreddato. Inserire a 50 hertz per tre minuti.
Dopo la lisi, aggiungere 600 microlitri di metanolo freddo e vorticare per un minuto. Posizionare il tubo su uno shaker girarrosto a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Per estrarre i metaboliti dalle cellule di symbiodiniacae liofilizzate separate, aggiungere 200 microlitri di metanolo freddo con standard interni alle cellule di symbiodiniacae essiccate.
Quindi aggiungere perle di vetro lavate con acido e posizionare il tubo in un inserto per mulino a perline pre-raffreddato a 50 hertz. Dopo tre minuti, aggiungere 800 microlitri di metanolo e vorticare per 30 secondi. Per l'estrazione del metabolita dal tessuto ospite liofilizzato separato, aggiungere un millilitro di metanolo freddo contenente standard interni al materiale ospite essiccato e vorticare per 20 secondi.
Quindi posizionare il tubo in un supporto per tubo galleggiante per la sonicazione a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, per la purificazione dell'estratto di metaboliti, centrifugare tutti i campioni a 3000 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire con cautela il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga da due millilitri senza disturbare il pellet.
Risospendere il pellet in un millilitro di metanolo freddo al 50% e vorticare vigorosamente per un minuto. Centrifugare nuovamente, quindi raccogliere e raggruppare il surnatante degli estratti polari con gli estratti semipolari dello stesso campione. Centrifugare gli estratti raggruppati a 16, 100 G per 15 minuti per rimuovere i precipitati.
Per l'analisi, aliquotare 50 microlitri di ciascun estratto in un inserto di vetro e concentrare utilizzando un concentratore sottovuoto per 30 minuti a 30 gradi Celsius. L'analisi GCMS ha rivelato 107 metaboliti annotati in tutti i trattamenti, tra cui una serie di aminoacidi, acidi organici, carboidrati, acidi grassi e sterili. K significa che il clustering ha identificato tre distinti cluster di campioni.
I campioni di olobionte erano intermedi tra le frazioni separate dell'ospite e del simbionte. Sebbene K significhi che le distribuzioni dei cluster, le coordinate parallele e la visualizzazione della mappa di calore nell'abbondanza relativa del metabolita hanno indicato che il profilo dell'olobionte corrispondeva più da vicino al profilo della frazione ospite differiva significativamente sia dal profilo dell'ospite che da quello del simbionte. I profili dell'ospite e del simbionte erano significativamente distinti l'uno dall'altro con 100 metaboliti individuali, significativamente diversi tra le frazioni dell'ospite e del simbionte.
