Per iniziare, posizionare il chip e il supporto del chip nella culla del chip situata in un piatto sterile per coltura tissutale e tenerlo da parte nella cappa per coltura tissutale mentre si prepara il reagente di attivazione del chip. Aggiungere un millilitro della soluzione di CR2 al flaconcino contenente la polvere di CR1. Trasferire la soluzione dal flaconcino a una provetta da 15 millilitri avvolta in un foglio di alluminio.
Ripetere questo processo fino a quando non sono stati lavati quattro risciacqui e quattro millilitri di CR2 attraverso il flaconcino di CR1. Per l'ultimo risciacquo, tappare il flaconcino e capovolgerlo per rimuovere la polvere residua. Quindi, aggiungi sei millilitri di CR2 alla provetta da 15 millilitri contenente CR1.
Miscelare la soluzione finale da 10 millilitri con una pipetta senza introdurre bolle. Utilizzando un puntale per pipette da 200 microlitri, aggiungere 20 microlitri di soluzione CR1 all'ingresso del canale inferiore del chip fino a quando la soluzione inizia a uscire dall'uscita del canale inferiore. Aggiungere 50 microlitri di soluzione CR1 attraverso l'ingresso del canale superiore fino a quando la soluzione inizia a uscire dall'uscita del canale superiore.
Quindi, metti le patatine sotto la luce ultravioletta per 15 minuti. Dopo l'esposizione, rimuovere l'eventuale soluzione di CR1 dai canali superiore e inferiore. Lavare entrambi i canali con 100 microlitri di soluzione CR2.
Quindi, lavare due volte con 100 microlitri di DPBS. Preparare le soluzioni della matrice extracellulare per i canali superiore e inferiore del chip. Aggiungere 50 microlitri di soluzione di matrice extracellulare all'ingresso del canale inferiore fino a quando la goccia non appare sull'uscita.
Quindi, aggiungere 50 microlitri all'ingresso del canale superiore fino a quando la goccia non appare sull'ingresso. Aggiungere DPBS al serbatoio della culla del truciolo. Metti il coperchio sulla piastra e incuba le patatine per una notte a 37 gradi Celsius e incubatrice al 5% di anidride carbonica.
Il giorno successivo, lavare il canale epiteliale o superiore del chip con 100 microlitri di terreno di espansione del chip preriscaldato. Quindi, lavare il canale endoteliale o inferiore con 100 microlitri di terreno HIMEC preriscaldato. Dopo il conteggio, aggiungere 10 microlitri di HIMEC al canale endoteliale.
Se necessario, aggiungere terreni di crescita organoidi o terreni di espansione del chip al canale epiteliale e controllare la densità di semina degli HIMEC. Quindi, capovolgere il chip nella culla del chip posizionata nella piastra di coltura cellulare, aggiungere DPBS al serbatoio nella culla del chip e posizionare il chip a 37 gradi Celsius per due o tre ore per consentire agli HIMEC di attaccarsi alla membrana del chip. Dopo l'incubazione, riportare la culla del truciolo in posizione verticale.
Lavare delicatamente il canale endoteliale con 100 microlitri di terreno HIMEC caldo e il canale epiteliale con terreni di crescita organoidi o terreni di espansione del chip, lasciando il terreno nel canale. Per la raccolta degli enteroidi, aspirare delicatamente il terreno e lavare i pozzetti contenenti l'idrogel della matrice di coltura cellulare con 500 microlitri di DPBS caldo. Aggiungere 250 microlitri di soluzione di recupero delle celle fredde a ciascun pozzetto e grattare il fondo di ciascun pozzetto con un puntale di pipetta nuovo per interrompere l'idrogel della matrice di coltura cellulare.
Aggiungere la sospensione cellulare interrotta in una provetta fredda da 15 millilitri su ghiaccio e incubare per 45 minuti. Dopo l'incubazione, centrifugare la sospensione e rimuovere il surnatante. Quindi, aggiungere due millilitri di terreno caldo di dissociazione enteroide al pellet e posizionare il tubo in un bagnomaria a 37 gradi Celsius.
Per 60-120 secondi, quindi, aggiungere 10 millilitri di materiale di lavaggio dei tessuti freddi al tubo. Quindi, centrifugare e rimuovere il surnatante prima di risospendere il pellet in 200 microlitri di mezzi di espansione del truciolo. Utilizzando una pipetta P200, dissociare gli enteroidi e aggiungere la sospensione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Contare le celle e regolare il volume del mezzo di espansione del chip per ottenere una concentrazione da sei volte 10 a sei celle per millilitro. Quindi, aggiungere 30 microlitri di sospensione cellulare risospesa al canale superiore del chip. Dopo aver rimesso i trucioli nella culla del chip, aggiungere DPBS al serbatoio e incubare i chip per una notte a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.
Il giorno successivo, lavare due volte il canale epiteliale con 100 microlitri di terreno di espansione del chip e il canale endoteliale con 100 microlitri di terreno HIMEC. Quindi, aggiungere due millilitri del mezzo di espansione del chip al serbatoio di ingresso del canale superiore e 300 microlitri al serbatoio di uscita del canale superiore. Aggiungere due millilitri di materiale filtrante HIMEC al serbatoio di ingresso del canale inferiore e 300 microlitri al serbatoio di uscita del canale inferiore.
Adescare i baccelli e aggiungere le patatine ai baccelli. Aggiungere quindi i pod al modulo culture. Impostare una portata di 30 microlitri all'ora e avviare il ciclo.
Le cellule epiteliali intestinali cresciute utilizzando l'intestino neonatale su un chip formavano un monostrato di cellule confluenti e successivamente si sviluppavano in una struttura simile a villi tridimensionali maturi. L'aggiunta di un microbioma disbiotico da un neonato con grave enterocolite necrotizzante all'intestino neonatale su un modello di chip ha mostrato una maggiore espressione di TNF-alfa rispetto al controllo.
