Per iniziare, prendi un millilitro di una coltura cellulare di lievito in gemmazione in fase intermedia, esprimendo HyPer7 mirato ai mitocondri. Centrifugare le cellule a 6.000 g per 30 secondi e rimuovere il surnatante, lasciando da 10 a 20 microlitri nella provetta. Risospendere il pellet cellulare mescolandolo delicatamente con il terreno residuo utilizzando una micropipetta.
Successivamente, utilizzare un soffiatore d'aria o un fanno privo di lanugine per pulire un vetrino da microscopio e aggiungere 1,8 microlitri di sospensione cellulare al vetrino. Infine, coprire le celle con il vetrino coprioggetti numero 1,5 abbassandolo lentamente ad angolo per evitare di introdurre bolle. Quindi posizionare il vetrino sul tavolino del microscopio.
Per ottenere l'immagine delle cellule, impostare le condizioni di acquisizione per garantire un segnale rilevabile e una risoluzione accettabile in ciascun canale di fluorescenza. Ad esempio, su un microscopio confocale a disco rotante con una fotocamera sCMOS utilizzare il binning 2x2, la potenza laser dal 20 al 40% e l'esposizione da 200 a 600 millisecondi. Quindi, esamina l'istogramma dell'immagine.
In un'immagine a 12 bit, assicurarsi che la gamma dinamica totale dei valori dei pixel sia di almeno diverse centinaia di livelli di grigio senza saturazione. Inoltre, assicurati che la portata sia di un ordine di grandezza superiore al livello di rumore. Per calcolare il livello di disturbo, misurare la deviazione standard dei valori dei pixel in un'area priva di celle di un'immagine.
Quindi raccogli immagini time-lapse senza ritardi tra le acquisizioni per valutare gli effetti delle condizioni di imaging sulla stabilità del segnale e sullo stress ossidativo nei mitocondri. Utilizzando il software di acquisizione del microscopio o ImageJ, misurare il valore medio dei pixel in ciascun canale di fluorescenza per garantire la stabilità del segnale. Se l'esperimento non prevede l'imaging time-lapse, assicurarsi che la fluorescenza sia stabile su due o tre Z-stack ripetuti.
Acquisisci immagini con un intervallo Z di 0,5 micrometri in una profondità totale di sei micrometri per il lievito in gemmazione. Se si raccolgono pile Z, assicurarsi che l'intervallo Z sia lo stesso per tutte le immagini nel set di dati e includere l'intera cella. Acquisisci anche immagini a luce trasmessa per documentare i confini delle celle.
