Per iniziare, apri un'immagine dello stack Z multicanale nelle Figi e apri il file di script di analisi del biosensore desiderato. Fare clic su Esegui nella finestra dell'editor di script per eseguire lo script. Quindi inserisci le informazioni richieste nella finestra di dialogo che appare.
Selezionare i numeri di canale del numeratore e del denominatore per il calcolo del rapporto. Per i mitocondri mirati a HyPer7, il numeratore è il canale eccitato a 488 nanometri e il denominatore è il canale eccitato a 405 nanometri. Selezionare il numero di canale dell'immagine a luce trasmessa, se presente, o zero se non ce n'è.
Quindi scegli il metodo di sottrazione dello sfondo desiderato. Se lo sfondo è uniforme, fare clic su Seleziona un'area dell'immagine per misurare il livello di sfondo nell'immagine. Successivamente, scegli il metodo di sottrazione del rumore desiderato per ridurre la variazione casuale nella lettura del rilevatore.
Fare clic su Seleziona un'area dell'immagine. Selezionare l'opzione del valore fisso per immettere un livello di rumore misurato in precedenza, che di solito funziona bene se le condizioni di imaging vengono mantenute costanti. Per un rilevamento accurato e coerente dei mitocondri, selezionare un algoritmo di soglia come Otsu o Entropia massima.
Usa lo stesso algoritmo per tutte le immagini in un esperimento, ma assicurati che i mitocondri siano riconosciuti accuratamente. Selezionare quindi il numero di aree di interesse per cella. Ad esempio, se misuri le differenze tra le gemme madri, selezionane due.
Selezionare la cartella di output in cui verranno salvate le immagini delle misurazioni e dei rapporti. Per la correzione dello sfondo o del rumore, scegliete Seleziona un'area dell'immagine. Seguire le istruzioni per disegnare un'area di sfondo utilizzando lo strumento ROI rettangolo e fare clic su OK.
Durante l'analisi delle singole cellule o delle regioni subcellulari, disegnare le regioni di interesse in base all'immagine in campo chiaro. Non è necessario che il ROI corrisponda con precisione al contorno della cellula, poiché verranno misurati solo i mitocondri con soglia all'interno del ROI. Dopo aver creato ogni ROI, premere T per aggiungere il ROI selezionato a ROI Manager.
Selezionare Mostra tutto in Gestione ROI per documentare le celle contrassegnate. Ogni area aggiunta verrà visualizzata come elemento numerato nell'elenco ROI Manager. Se si analizza più di un ROI per cella, contrassegnare i ROI nello stesso ordine per ogni cella analizzata.
Dopo che tutte le ROI desiderate sono state aggiunte al gestore ROI, fare clic su OK nella finestra di dialogo Contrassegna celle. Quindi, seleziona il formato della tabella di misurazione. Nella finestra di dialogo Misura multipla, selezionare le opzioni Misura tutte le sezioni e Una riga per sezione per produrre una tabella con il formato desiderato.
Utilizzare le tabelle multi ROI del processo. rscript per elaborare le tabelle create con l'opzione one-row-per-slice. Non selezionare l'opzione append-results.
Salvare i file di output nella cartella selezionata utilizzando lo script. Ora apri l'immagine dello stack del rapporto Z nelle Figi per generare un'immagine del rapporto colorato. Quindi apri il colorize_ratio_image.
ijm e fare clic su Esegui nella finestra dell'editor di script. Apparirà una finestra di dialogo che richiede di inserire le informazioni richieste. Nell'opzione non modulata, tutti i pixel mitocondriali appaiono alla stessa luminosità.
Alcune immagini possono apparire rumorose poiché i pixel deboli e luminosi contribuiscono al rapporto dell'immagine. Utilizzare l'opzione di modulazione dell'intensità per ridurre il rumore. Nel metodo dei valori minimi e massimi visualizzati, scegliere valori vicini ai valori minimi e massimi medi osservati in un esperimento.
Per garantire la coerenza, acquisire tutte le immagini utilizzando le stesse condizioni di imaging e visualizzare tutte le immagini utilizzando gli stessi valori minimo e massimo. Quindi selezionare la modalità di proiezione per proiettare la pila Z e mostrare l'intera popolazione mitocondriale prima della colorazione. Per una proiezione di intensità massima, selezionare Massima.
Per creare una proiezione di intensità media, selezionare media. Infine, seleziona la cartella in cui salvare le immagini colorate. Se l'opzione non modulata è selezionata, scegli una combinazione di colori nella finestra di dialogo che appare.
Utilizza le tabelle di ricerca RGB fuoco o arcobaleno integrate in Fiji o qualsiasi tabella di ricerca desiderata nel formato LUT di ImageJ. Utilizzare lo script per salvare i file di output nella cartella selezionata. Il rapporto ossidato ridotto dei mitocondri marcati HyPer7 ha mostrato una risposta dose-dipendente alla concentrazione di perossido di idrogeno, che ha raggiunto un plateau a uno o due millimolari di perossido di idrogeno aggiunto esternamente.
Sono state osservate differenze nel perossido di idrogeno mitocondriale all'interno delle cellule di lievito. Una diminuzione statisticamente significativa della lettura del biosensore di perossido di idrogeno è stata rilevata nei mitocondri nel germoglio rispetto alla cellula madre.
