Il giorno zero è stato possibile impiattare 10 milioni di cellule 293T in 30 millilitri di DMEM privo di antibiotici contenente il 10% di FBS in un piatto da 15 centimetri. Prepara un totale di 10 piatti di questo tipo. Il giorno successivo, che è il primo giorno, verificare che le cellule siano confluenti all'80% e pronte per la trasfezione.
Quindi, in una provetta conica da 50 millilitri in sequenza, aggiungere 600 microlitri di miscela di plasmidi da 0,5 microgrammi per confezione da microlitro e una libreria di codici a barre plasmidici da 60 microlitri. In una provetta conica separata da 15 millilitri miscelare 900 microlitri di reagente di trasfezione e 12 millilitri di DMEM mediante vortex. Aggiungi 12,9 millilitri di questa miscela alla miscela di DNA e basta muovere per unire.
Senza mescolare ulteriormente, incubare la miscela a temperatura ambiente per 15 minuti. Quindi aggiungere 2,5 millilitri della miscela incubata a ogni piatto da 15 centimetri contenente le cellule 293T e incubare le cellule per una notte in un incubatore per colture tissutali. Il terzo giorno, raccogliere il virus facendo passare il terreno attraverso un'unità di filtrazione da 0,2 micron.
Aliquotare il filtrato contenente particelle virali in provette coniche da 15 millilitri. Inoltre, preparare cinque aliquote da un millilitro di virus filtrato in fiale criogeniche per la titolazione virale. Per titolare i pool lentivirali, aggiungere 65 microlitri di polimero cationico a un pallone di vetro sterile contenente 65 millilitri di terreno di coltura delle cellule tumorali.
Pipettare un millilitro di terreno contenente polimero per pozzetto in 11 piastre di coltura tissutale a sei pozzetti. Successivamente, tripsinizzare le cellule tumorali di passaggio precoce. Dopo aver contato le cellule utilizzando un metodo preferito, trasferire le cellule nelle piastre a sei pozzetti.
Scongelare le aliquote di un millilitro del lentivirus di 48 ore dal congelatore a bagnomaria a 37 gradi Celsius. Seguire la tabella per preparare l'infezione per ogni modulo virale.
