Per l'infezione lentivirale, piastre le cellule bersaglio MPNST tripsinizzate dopo averle contate, mantenendo 2,5 milioni di cellule per piatto da 15 centimetri. Trasdurre le cellule con il virus scongelato ad una molteplicità di infezione pari a 0,5, in presenza di cinque microgrammi per millilitro del polimero cationico. Tripsinizzare le cellule tre giorni dopo l'aggiunta di puromicina.
Centrifugare metà della popolazione cellulare a 200 G per cinque minuti in una centrifuga da tavolo. Dopo aver riplaccato l'altra metà della popolazione cellulare, coltivarle per circa sette raddoppi di popolazione prima di raccogliere e centrifugare come dimostrato in precedenza. Dividere il pellet cellulare risospeso corrispondente al tempo desiderato in due provette di polimetilpentene da 15 millilitri.
Aggiungere 500 microlitri di SDS al 10% per provetta. Mescolare e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Metti le provette in un dispositivo di taglio del DNA per sonicare il DNA.
A seguito dell'aggiunta di fenolo e cloroformio. Mescolare bene facendo vorticare energicamente alla massima velocità possibile per 45-60 secondi. Trasferire tre millilitri della fase superiore trasparente risultante da ciascuna provetta a un'altra provetta fresca da 15 millilitri.
Aggiungere 0,5 millilitri di acetato di sodio a tre molari e quattro millilitri di isopropanolo e mescolare bene. Dopo aver centrifugato le provette per 30 minuti a 7, 200 G e 20 gradi Celsius e aver scartato il surnatante, aggiungere 0,5 millilitri di etanolo al 70% al pellet e rimuoverlo pipettando su e giù. Unire i pellet risolti da entrambe le provette in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri.
Eseguire le reazioni PCR utilizzando le condizioni mostrate sullo schermo. Dopo la seconda reazione PCR, unire i quattro campioni in una provetta per microcentrifuga. E aggiungi 80 microlitri di colorante di caricamento 6X.
Visualizzare il gel e confermare una banda a circa 250 paia di basi. Le cellule umane MPNST trasdotte con un controllo non bersaglio e lentivirus, esprimendo quattro diversi RNA a forcina corta Bcl-6, hanno rivelato che molti degli RNA a forcina corta Bcl-6 hanno ridotto notevolmente il numero di cellule. L'immuno blot ha mostrato che il grado di diminuzione del numero di cellule era correlato al grado di knockdown di Bcl-6.
