Per iniziare, fissa gli arti di un topo anestetizzato con del nastro adesivo. Tenere la pelle dell'addome verso l'alto e tagliare con cura lungo la circonferenza del torace per esporla completamente. Praticare un piccolo taglio nell'atrio destro con le forbici oftalmiche e inserire immediatamente un ago di perfusione calibro 22 all'apice del ventricolo sinistro.
Quindi spingere da 30 a 50 millilitri di liquido di perfusione cardiaca attraverso la siringa. Dopo che il fluido in uscita dall'atrio destro diventa completamente limpido, infondere un volume uguale di soluzione di PFA al 4%. Sezionare i tessuti e gli organi e fissarli durante la notte con PFA al 4% a quattro gradi Celsius.
Per indurre la decalcificazione dei tessuti. posizionare il tessuto cardiaco fisso in 10 millilitri di soluzione EDTA su un tavolo vibrante a 37 gradi Celsius. Incubare per circa due giorni e cambiare il liquido ogni giorno.
Mettere le ossa della calvaria fissate in 20 millilitri di soluzione di Quadrol al 25% per la decolorazione dei tessuti. Incubare su un tavolo vibrante a 37 gradi Celsius per un giorno e cambiare il fluido una volta. Successivamente, posizionare il tessuto in sequenza in una soluzione di butanolo terziario al 30% o TB.
Quindi soluzione al 50% di TB e quindi soluzione al 70% di TB per eseguire lo sgrassaggio a gradiente. Successivamente, disidratare i campioni e la soluzione di PEG TB per sei ore su un tavolo vibrante a 37 gradi Celsius. Infine, posizionare il tessuto completamente disidratato in una soluzione di BB PEG su un tavolo vibrante a 37 gradi Celsius.
Dopo due o quattro ore di incubazione, il tessuto diventerà trasparente. Il metodo PEGASOS Tissue Clearing ha portato a un tessuto trasparente. Il tessuto eliminato con colorazione EDU a monte intero ha dimostrato che l'etichettatura era efficiente e ben conservata.
Nel gruppo di controllo, diverse cellule positive all'EDU sono state distribuite in modo diffuso in tutte le suture. Dopo un giorno di espansione della sutura, sono state osservate cellule proliferanti al centro e ai bordi della sutura. Man mano che la sutura si allargava, il numero di cellule proliferanti diminuiva nel tempo.
Le cellule marcate in verde erano piccole cellule rotonde nel midollo osseo, che differivano dalle cellule di sutura positive all'EDU.
