Rat Retina Excision and Mounting on Porous Membrane for Calcium Imaging

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August 18th, 2023

DOI :

10.3791/200529-v

August 18th, 2023

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Marina Cunquero¹, Maria Marsal¹, Gustavo Castro-Olvera¹, Steven T. Walston², F. Taygun Duvan², José Gabriel Macias-Montero³, Carles Puigdengoles³, Mokhtar Chmeissani³, Jose A. Garrido²^,⁴, Pablo Loza-Alvarez¹

¹Institut de Ciències Fotòniques (ICFO), The Barcelona Institute of Science and Technology, ²Catalan Institute of Nanoscience and Nanotechnology (ICN2), CSIC and BIST, Campus UAB, ³Institut de Física d'Altes Energies (IFAE), The Barcelona Institute of Science and Technology, Campus UAB, ⁴Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA)

Trascrizione

Due o tre settimane prima dell'imaging, il vitreo dell'occhio di un ratto anestetizzato viene iniettato con le particelle virali che trasportano l'indicatore di calcio geneticamente codificato. Utilizzando la fundoscopia e l'OCT, la struttura retinica viene esaminata per le reazioni avverse dall'iniezione dell'indicatore di calcio. Due settimane dopo l'iniezione, lo strato di cellule gangliari o GCL ha mostrato un'emissione di fluorescenza.

Quindi viene avviata l'escissione della retina dal ratto eutanasiato. Prendi gli occhi che esprimono AAV2-CAG-GCaMP5G e rimuovi tutto il tessuto che circonda il bulbo oculare usando piccole pinze curve e forbici a molla fine. Quindi, prendi un pezzo di carta da filtro di tre centimetri per tre.

Posizionarlo sul coperchio di un piatto da 3,5 centimetri e bagnare la carta da filtro con il mezzo AIMS. Posizionare il bulbo oculare sulla carta con il segmento anteriore orientato verso l'operatore. Utilizzare un paio di pinze diritte per tenere il bulbo oculare a un angolo di circa 45 gradi dalla superficie del piatto.

Usa lo spazio tra le pinze diritte per guidare un'incisione con una lama. Quindi immergere il bulbo oculare nel mezzo AIMS. Usa una pinza diritta e forbici a molla fine per separare i segmenti anteriori e posteriori dell'occhio.

Rimuovere con cautela la lente utilizzando due paia di pinze diritte e staccare la retina dalla sclera. Usando delle forbici a molla sottili, praticare un'incisione nella sclera verso il nervo ottico e tagliare fino a quando la retina non è stata separata con successo dall'oculare. Trasferire il pezzo asportato della retina sulla membrana di montaggio utilizzando una pipetta di plastica con punta tagliata.

Quindi utilizzare un paio di pinze diritte per montare la retina in piano, assicurandosi che lo strato di cellule gangliari sia orientato verso l'alto. Successivamente, utilizzare una pipetta di plastica dotata di un puntale da 100 microlitri per rimuovere il terreno, facilitando l'aderenza del pezzo di retina alla membrana porosa. Quindi, capovolgere il gruppo sull'array di microelettrodi o MEA, posizionando il GCL sopra gli elettrodi.

Quindi riempire il bagno del campione con terreno AIMS ossigenato.