Posizionare la retina di ratto che esprime GCaMP 5G montata sul MEA con il GCL rivolto verso gli elettrodi sul tavolino del microscopio. Collegare il sistema di perfusione e impostare i parametri per perfondere costantemente il bagno del campione con il mezzo AMS ossigenato. Successivamente, ispezionare la retina utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita dotato di una lampada fluorescente, un filtro FITC e una fotocamera CMOS.
Cerca un'area in cui siano visibili gli elettrodi stimolanti e la fluorescenza delle cellule che esprimono GCaMP. Nel software dei dispositivi generatori di impulsi, configurare i parametri di stimolazione elettrica come la forma, l'ampiezza, la durata, il ritardo di fase e la frequenza degli impulsi per l'applicazione. Collegare la telecamera al generatore di impulsi utilizzando il segnale di attivazione in uscita e impostare la modalità di acquisizione del software della fotocamera su trigger di avvio esterno.
Premere il pulsante di avvio nel software della fotocamera in modo che attenda l'avvio di un trigger esterno. Avviare il processo di acquisizione delle immagini utilizzando il software generatore di impulsi e salvare le immagini acquisite, assicurandosi che il nome del file includa tutti i parametri di stimolazione elettrica applicati. Ora apri l'immagine J e segmenta la regione di interesse utilizzando gli strumenti di selezione dell'area, aggiungila al gestore ROI e salvala come cartella zip utilizzando il menu Gestione ROI.
Estrai il valore medio del grigio dai soma della cella navigando su altro e facendo clic su multi misura. Abilita le opzioni Misura tutte le 600 sezioni e una riga per sezione per ottenere un'unica tabella in cui le colonne corrispondono ai ROI e le righe corrispondono agli intervalli di tempo. Quindi estrarre il centroide dalle ROI utilizzando il comando measure.
Per correggere l'effetto di sbiancamento della foto e ridurre al minimo lo sfondo, selezionare circa 15-20 fotogrammi dagli intervalli non stimolanti prima di ogni raffica e adattare questi fotogrammi a una curva lineare per garantire un'analisi ottimale dei dati. Vengono mostrate le tracce di calcio dei somi cellulari su cinque raffiche di treni di impulsi ogni 10 secondi durante un'acquisizione di immagini di 60 secondi. Le cornici dei periodi non stimolanti vengono utilizzate per correggere l'effetto sbiancante della foto.
La relazione tra la corrente necessaria per attivare le celle e la distanza dall'elettrodo stimolante ha mostrato che le celle situate più vicino all'elettrodo stimolante richiedevano valori di corrente più bassi per evocare una risposta.
