Per iniziare, posizionare il mouse C57 Black/6 JRj anestetizzato. Supino su un tavolo operatorio riscaldato. Confermare l'assenza di risposte riflesse al pizzicamento delle dita dei piedi.
Spruzza il mouse con etanolo al 70% per evitare che i capelli si attacchino alle forbici. Usando le forbici, fai un'incisione addominale alla base, tagliando verso l'alto su entrambi i lati della gabbia toracica per esporre la cavità addominale. Usa un batuffolo di cotone per spostare l'intestino verso destra, esponendo la vena porta.
Usando una pinza curva, posiziona due legature sotto la vena porta e lega senza stringere ciascuna legatura. Successivamente, inserire un catetere da 0,7 millimetri nella vena porta. Una volta perforato, rimuovere l'ago dal catetere e guidare il catetere attraverso la vena fino a quando la punta del catetere non è vicina al fegato.
Quindi, stringere le legature. Osserva il fegato. Impostare la portata dalla pompa a rulli e collegare il tubo di profusione.
Iniziare la profusione del fegato a 37 gradi Celsius. Una volta che il fegato diventa pallido, usa le forbici per tagliare la gabbia toracica e il diaframma. Quindi, utilizzando una pinza a punta fine, posizionare la legatura sotto la vena cava inferiore sopraepatica.
Successivamente, inserire un catetere nella vena cava inferiore sopraepatica attraverso l'atrio destro del cuore. Una volta perforato, rimuovere l'ago e guidare il catetere attraverso la vena più vicina al fegato. Quindi, stringi la legatura.
Collegare un tubo per la raccolta dell'effluente di perfusione e fissare tutti i tubi con nastro impermeabile. Utilizzando un adattatore per morsetto vascolare, posizionare un morsetto vascolare attraverso la vena cava infraepatica immediatamente sopra la vena renale destra per evitare la miscela morta. Successivamente, aumentare la portata di perfusione a 3,5 millilitri al minuto.
Avviare il timer e la registrazione della pressione. Coprire il fegato con un telo sterile inumidito con soluzione fisiologica, equilibrare per 30 minuti e misurare il volume dell'effluente. Dopo 30 minuti di equilibrazione, iniziare l'esperimento per la prima raccolta di campioni di base nel raccoglitore di frazioni.
Monitorare regolarmente la trappola per bolle e riempirla con il tampone di perfusione quando è quasi vuota. Prelevare un campione tampone tramite un rubinetto a tre vie immediatamente prima che entri nell'organo e dal catetere di raccolta inserito nella vena cava inferiore. Utilizzando un analizzatore di gas ematici, misurare il campione raccolto per confermare che l'organo è metabolicamente attivo.
Dopo 15 minuti di perfusione basale, utilizzando una pompa a siringa, avviare la prima stimolazione infondendo una sostanza in esame attraverso un rubinetto a tre vie alla portata desiderata. Dopo la simulazione, raccogliere campioni di base per 20-30 minuti prima di iniziare la seconda stimolazione. La produzione di urea nel fegato perfuso con periodi basali costanti che precedono ciascuno dei due periodi di stimolazione ha suggerito che la risposta dell'urea a due stimolazioni consecutive con aminoacidi misti è coerente.
È stato osservato un rilascio basale costante di glucosio e acidi grassi non esterificati. Prima di un robusto aumento del glucosio e degli acidi grassi non ED durante l'infusione di glucagone. Il valore medio allo stato basale e durante l'infusione di glucagone suggerisce che il glucagone stimola rapidamente la glicogenolisi epatica e la lipolisi.
Tuttavia, senza periodi basali costanti, diventa impossibile distinguere una risposta ureica dall'altra.
