Per iniziare, prepara i quattro fogli di carta da filtro, ciascuno dei quali misura 12,5 x 7,5 centimetri. Impila due fogli insieme e posiziona la pila nel buffer di trasferimento per immergerla. Mettere la membrana in PVDF in etanolo al 95% e agitare la membrana su un bilanciere per un minuto.
Ricorda l'etanolo. Immergere la membrana nel tampone di trasferimento. E agitare per due minuti.
Quindi, appoggiare la pila di carta da filtro per ammollo su una superficie piana e mobile, come un coperchio grande e appiattirla usando un rullo. Utilizzando un distaccante di gel o una pinzetta, posizionare con cura la membrana in PVDF sulla pila. Successivamente, posizionare un singolo foglio di carta da filtro asciutta su questa membrana e far scorrere il rullo sulla carta per assorbire il tampone in eccesso che si trova sulla superficie della membrana.
Sollevare la carta da filtro superiore senza strofinare contro la membrana. Prelevare campioni di fibre isolate dal congelatore e scongelarli a temperatura ambiente prima di centrifugare e risospendere accuratamente il campione. Posizionare una gocciolina di un microlitro di ciascun campione al centro dell'area della membrana designata.
Evitare di toccare la membrana con il puntale della pipetta. Lasciare che le goccioline del campione vengano assorbite completamente nella membrana per 15 minuti. Quindi, utilizzando un distaccatore di gel o una pinzetta, sollevare con cautela la membrana dall'annuncioamp pila di carta da filtro.
Adagiatela su un foglio di carta da filtro asciutto e lasciatela disidratare per almeno cinque minuti. Riattivare la membrana dopo che le macchie del campione sono diventate completamente bianche. Quindi procedere con l'immunomarcatura della proteina bersaglio.
Scopri come utilizzare l'intensità del pannello del segnale per classificare l'intensità delle isoforme MHC e dei segnali di actina dalle immagini dot blot. Il rilevamento di proteine bersaglio forti, medie e piccole è mostrato rispettivamente da segnali saturi, moderati e deboli. Per l'identificazione del tipo di fibra, confrontare inizialmente i risultati della catena pesante IIA della miosina e della catena pesante della miosina.
Documentare le fibre che mostrano solo una singola isoforma della catena pesante della miosina con intensità del segnale satura o moderata. Registrare le fibre rilevate con l'actina e nessun rilevamento della catena pesante della miosina uno o IIA come potenziale tipo 2X. Se è presente un debole segnale di isoforma a catena pesante di miosina con un segnale di actina moderatamente desaturata, registrarlo come non identificato.
Scartare i campioni con proteine bersaglio deboli o non rilevate. Le fibre che mostrano segnali saturi o moderati sia di MHCIIA che di MHC1 non devono essere utilizzate per la preparazione specifica del tipo di fibra. Dopo l'ID MYO1D, preparare campioni di tipo uno e due combinando fibre con segnali saturi o moderati per la rispettiva isoforma MHC.
Utilizzare 10 microlitri di ciascun campione specifico per tipo di fibra e separarli su un gel prefabbricato per pagina SDS, seguendo le linee guida del produttore. Utilizzare un gel imager per rilevare l'isoforma MHC target, seguendo il protocollo del produttore. Confrontare l'intensità del segnale di ciascuna isoforma MHC in tutti i campioni specifici del tipo di fibra.
L'ID del tipo di fibra è confermato dalla corretta isoforma MHC a intensità del segnale moderata o satura. L'immunomarcatura del dot blot ha permesso l'identificazione di fibre di tipo due, fibre di tipo uno e potenziali fibre di tipo 2X. I campioni specifici per tipo di fibra sono stati convalidati, utilizzando il western blotting e gli anticorpi specifici per la catena pesante della miosina.
