Iniziare preparando il terreno di coltura endoteliale completo utilizzando 460 millilitri di terreno cellulare endoteliale e aggiungendovi 50 millilitri di FBS, cinque millilitri di penicillina streptomicina e cinque millilitri di integratore per la crescita delle cellule endoteliali. I terreni preparati possono essere conservati a quattro gradi Celsius per un mese. Successivamente, in una piastra di coltura tissutale da 100 millimetri contenente 0,1 milioni di cellule vascolari a otto millilitri del terreno di coltura endoteliale completo preparato e coltivare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica fino a raggiungere il 70% di co-fluenza.
Quindi, rimuovere il terreno di coltura dalla piastra e sciacquare le cellule due volte con PBS per eliminare le cellule non attaccate e i detriti. Dopo aver rimosso il PBS, aggiungere tre millilitri di tripsina allo 0,25%, contenente 2,21 millimolari di EDTA alle cellule e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un minuto. Verificare il distacco delle cellule al microscopio ottico con un ingrandimento di 40 volte.
Neutralizzare la tripsina con sette millilitri di terreno di coltura endoteliale completo e risciacquare delicatamente le cellule dal piatto di coltura. Centrifugare la sospensione cellulare dopo averla raccolta in una provetta da 15 millilitri a 400 G per 10 minuti. Sospendere nuovamente le cellule in cinque millilitri di terreno di coltura endoteliale completo dopo aver rimosso il surnatante, quindi contare le cellule utilizzando un emocitometro e trasferire un volume calcolato di sospensione contenente 2 milioni di cellule in una provetta sterile da 1,5 millilitri.
Pellettare le cellule centrifugando la sospensione a 400 G per cinque minuti prima di rimuovere il surnatante. Le cellule vascolari sono ora pronte per la miscelazione con il gel della matrice per il saggio del gel plug della matrice.
