Per iniziare, con un bisturi, fai un'incisione lungo la linea mediana dorsale di un topo soppresso dalla regione occipitale a quella sacrale. Utilizzando un microscopio operatorio stereoscopico, sezionare accuratamente gli strati fino alla colonna lombare. Identifica l'ultimo arco costale.
Identificare l'ultima vertebra cervicale e l'osso sacro. Quindi fai un taglio per separare la colonna vertebrale. Con un paio di pinze da dissezione, eseguire una laminectomia dorsale della vertebra per estrarre il midollo spinale.
Rimuovere i nervi che emergono attraverso i forami che costituiscono il sistema nervoso periferico. Ora, posiziona il midollo spinale estratto su una tavola da dissezione. Con un paio di forbici vannas, tagliatelo a pezzi di due millimetri.
Quindi trasferire i pezzi in una microprovetta a fondo piatto da due millilitri. Aggiungere un millilitro di soluzione di lavoro HBSS-LD alla microprovetta. Incubare la miscela a 37 gradi Celsius per 25 minuti.
Assicurati di agitare vigorosamente la miscela ogni cinque minuti. Successivamente, passare il contenuto di ogni digestione attraverso un colino da 40 micron. Quindi aggiungere sette millilitri di HBSS con il 2% di FBS per neutralizzare la digestione e schiacciare il tessuto rimanente.
Trasferire la sospensione in una provetta conica da 50 millilitri prima di centrifugarla a 220 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Ora usa una micropipetta da un millilitro per scartare il surnatante. Quindi risospendere il pellet in due millilitri di HBSS-FBS in un nuovo tubo conico da 15 millilitri.
Aggiungere due millilitri di terreno a gradiente di densità isotonica al 90% nella provetta e centrifugare la miscela a 160 g per 25 minuti a 18 gradi Celsius. Infine, con una pipetta di trasferimento, recuperare l'interfase e trasferirla in una provetta conica da 15 millilitri. Lavare le cellule con 10 millilitri di PBS, quindi centrifugare le cellule a 220 g per cinque minuti a cinque gradi Celsius prima di ulteriori esperimenti.
La purificazione delle cellule microgliali estratte ha prodotto fino al 99% di resa cellulare, come confermato dalla colorazione FACS. Sono state osservate cellule doppie positive con una dimensione media di 10 micrometri coerenti con la microglia non attivata.
